轉基因生物檢測方法研究進展

李夏瑩，張秀杰，宋貴文

（農業部科技發展中心，北京 100176）

轉基因生物檢測方法研究進展

李夏瑩，張秀杰，宋貴文

（農業部科技發展中心，北京 100176）

隨著轉基因技術在農業領域的迅速應用與發展，轉基因產品的種類與數量逐漸增加，轉基因產品的安全性也越來越被社會公眾廣泛關注，轉基因檢測技術體系也迫切需要持續的創新與發展。簡要介紹了轉基因作物尤其是非授權轉基因作物的成分分析檢測思路及方法，目前轉基因檢測主要是基于外源蛋白和核酸成分的檢測技術及方法，如酶聯免疫吸附技術、PCR技術、等溫擴增技術等，另外還有一些檢測新技術如指紋識別，微陣列、高通量測序等，希望對我國轉基因生物安全管理工作有所啟發。

轉基因生物；生物安全；檢測方法；基因型；PCR技術

從1996年至今，轉基因生物（GMO）已經商業化20年，在此期間全球轉基因作物累計種植面積達到20億hm2，相當于中國國土面積的2倍，農民累計獲益超1 500億美元［1］。商業化種植的轉基因作物主要有大豆、玉米、棉花和油菜4種［2］。隨著科技的發展，轉基因生物的田間試驗和商業化速度不斷加快，轉基因涉及的物種、國家、遺傳元件的種類、國際貿易也日益增加，這就大大增加了GMO準確檢測的復雜性，故對轉基因檢測技術的研究和跟蹤顯得尤為重要［3-4］。

目前轉基因成分的檢測方法主要有以下四大類：一是基于核酸的檢測方法，包括基因芯片和PCR，根據原理不同PCR方法又分為普通PCR、多重PCR、巢式PCR、競爭PCR、實時熒光PCR、數字PCR，以及包含交叉引物擴增、LAMP、滾環擴增、依賴核酸擴增的恒溫擴增的方法［5］。二是基于蛋白的檢測方法，包括蛋白質印跡法（Western blot）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、免疫層析法，但這些方法都依賴于目標蛋白抗體的獲得，故存在一定難度。三是基于代謝物的檢測方法，包括直接分析檢測物成分的高效液相色譜法，以及雙向電泳法。四是其他的檢測方法，包括蛋白和核酸試紙條等快速檢測的方法。雖然方法很多，但是目前檢測中最常用的還是普通PCR和實時熒光PCR的方法。

GMO的檢測方法，包含非授權GMO的檢測方法，許多國家，包括歐盟，在法律上區分授權的（合法）和非授權的（非法）GMOs。目前已有的檢測方法和篩選元件并不能涵蓋非授權的GMOs，從而會出現漏檢的情況。針對這個問題，一些國際組織也作了一些積極的嘗試，如OECD Biotrack主動分享數據庫里轉基因事件的相關信息，但信息的不全面仍然給GMOs的檢測和鑒定帶來了挑戰，特別是非授權的GMOs［6］。本文主要闡述轉基因作物的檢測方法，為GMO的檢測提供參考。

1 GMO基因型和表型的檢測

目前大多數的GMO都是插入了一個外源的基因［7］，如果轉入的基因都是來源于受體物種本身，或者是能夠發生基因互換的物種，稱為基因順化。如果插入基因內部的元素發生了重排［8］，插入的部分或全部的DNA來源于其他物種，或者受體生物不能自發基因重排，GMO被分類為轉基因［9-10］。所有GM植物的基因修飾，都是由DNA序列信息的改變來定義的［11］。基因修飾也會發生在轉錄水平，但轉錄水平的調控很容易受到外界環境的影響，如年齡、成長階段、器官、組織、細胞類型、時間（晝夜、季節）的影響。故通過轉錄分析來檢測GMO并不是普遍適用的［12］，而直接對目的DNA序列的分析才可以有效區分假陽性和假陰性。外源基因翻譯產生的蛋白質也被認為是GMO的目標標簽，但由于密碼子存在簡并性不同的轉錄本會翻譯成相同的蛋白，且其穩定性不好，故不太適合于轉基因檢測。此外，也可以根據生物的表型辨別GMO，比如某種生物獲得轉基因特性之后可以耐受除草劑。但表型識別的應用范圍受到限制，以耐除草劑植物為例，植物在自然環境中生長，對除草劑產生抗性必須要區分好轉基因的表型和自然突變。

2 GMO分析的現代方法

2.1 模塊化的定義

在歐洲和其他很多國家，轉基因的分析有一個完整的程序（圖1）。

圖1 GMO分析程序

分析方法是分析程序的核心，被認為是有一系列的步驟。Holst-Jensen［13］和Trapmann等［12］指出：在歐盟的轉基因檢測體系中，DNA是唯一具有法律效應的被分析物。GMO檢測的程序包括樣品準備、DNA提取和純化、PCR擴增、數據分析［15］。目前通用的是根“模塊方法”，對于任何一個目標序列均包括：樣品準備、DNA提取、PCR。因此，一個模塊可以被定義為一個獨立的操作，輸入材料后，生成一個改變了的輸出材料或數據。例如：（1）在樣品準備模塊：輸入的是谷物，輸出的是粉末；（2）在DNA提取和純化模塊，輸入的是粉末，輸出的是溶于水的純化DNA；（3）在real-time PCR模塊，輸入的是純化的DNA，輸出的是熒光度和目的基因的拷貝數；（4）數據分析模塊，則將有效的數據加工成為最終的測量結果。

2.2 GMO檢測的模塊

模塊方法的優點在于增加了靈活性，是一種Ad Hoc設計合理的和成本有效的驗證和測試策略。模塊方法目前主要集中于用PCR的方法分析DNA，當然從理論上來講該方法還可以應用于別的目標不僅僅限于DNA。本文主要考察PCR模塊，因為該模塊是公認的應用于轉基因分析的模塊。

每一個分析模塊最顯著的特性是其特異性，對于PCR模塊在GMO檢測中有4個水平可區分其特異性（圖2）。

圖2 轉化過程中4個層次明確DNA序列特異性的方法

3 檢測非授權GMOs的方法

3.1 直接檢測注冊非授權GMO

最簡單的情況是個別樣品存在特定的未經授權轉基因，如2006年拜耳作物公司由美國向歐洲出口的大米中存在未經授權LL601事件，之后該公司緊急宣布此事件為無意釋放［14］。歐盟和挪威的官方實驗室使用構建特異性的檢測方法分析了此次事件中的所有大米，并很快確定了目標，詳見EURL-GMFF［16］。2010年，一份來自于美國的大米接受了挪威獸醫研究所的檢測，不同于直接檢測LL601大米，樣品接受了更為廣泛的篩選分析。分析結果顯示：可能存在其他非授權的大米，即Bt63。但Bt63轉基因水稻是迄今為止只追溯到中國水稻，并且從未在亞洲以外的地方發現該水稻的起源。進一步的分析發現：該樣品中包含Bt63 （RASFF reference no. 2010.0853），之后對該事件做出了澄清：來自USA的大米在來到歐洲之后混合了來自中國的大米。所以，樣品中Bt63的真正來源是亞洲，而不是USA。如果僅僅分析材料來源，Bt63大米將永遠不會被檢測到。對于非授權GMOs的檢測和分析，要綜合考慮各種因素，才可能得到準確的判斷。

3.2 基于篩選由單個或少量轉基因成分的產品測試

以PCR方法為基礎的篩選方法能否覆蓋所有的授權GMOs是需要考慮的問題。依據最近的情況，很有必要篩選更為廣泛的PCR檢測方法進行GMO篩選。如果法律規定只有官方認定的成分應該被考慮，那么非認定的成分存在于樣品中也將被認定為無關的，但這并不意味著它們不會干擾分析和混淆結果［17］。

檢測極限（LOD）是一個關鍵的參數。LODabs通常是目標基因的5～10個拷貝。對于每一次試驗，接近于LOD的濃度通常具有假陰性的風險。這是在分析結果時必須要考慮進去的。如果兩個篩查的目標都存在GMOs，只是插入的拷貝數不同，那么相應的LOD也會不同。完善的方法是不僅可以確定GMO是否存在，還可以確定檢測目標的濃度。濃度可以由標準曲線外推，但這樣的推算有一定的誤差。基于公開獲得的數據做出一個合理的假設，絕大多數的GMOs插入目的基因的拷貝數的比值表現在1∶1至1∶5的范圍。

3.3 基于多重篩選方式的GMO檢測方法

成分復雜的樣品和（或）DNA很容易降解的樣品會給檢測帶來很大的困難。DNA降解會顯著降低GMOs的可檢測度，因為在材料中目的序列的拷貝數會減少［18］。多種組分混合會減少特定組分的相對比例，導致目的序列在總DNA中的比例也會降低［19］。LODpract對于任何一個GMO來說，都是組分中DNA的完全數量，可以通過PCR分析獲得［20］， LODpract此受到過程和多種成分混合的影響。

檢測過程中存在3個難點：一是在低濃度的目的DNA，二是樣品成分復雜，三是不同品種的GMOs含有相同的篩選目標。如果一個樣品中存在來自3個品種（物種）的3個篩選元件或者1個樣品中是不同GMOs雜交的品種，這就意味著篩選的結果將很難解釋［21］。故轉基因生物的篩選方法，有必要明確篩選PCR是否可以檢測出現有品種中所有的GMOs［17］，或任何1個品種中的GMOs是否包含檢測元件。

4 應用于檢測的可選、先進的技術

分子生物學技術的進步，增加了插入不包含任何的遺傳元件的轉基因生物的數量。因此，一個生物樣品中存在著檢測模塊檢測不出來的GMO是真正的風險，建立合作專家網絡和研究新的檢測方法或許可以下降低風險。

4.1 指紋識別技術

Raymond等［22］概括了可用于GMO檢測和定性的有效分析工具，并探討了DNA指紋作為鑒定轉基因產品的一種替代方法［23］。從生物樣品中提取DNA，可運用PCR技術擴增出高可變位點（如VNTR系統，串聯重復的小衛星DNA等）或者完整的基因組DNA，然后將擴增出的DNA酶切成DNA片斷，經瓊脂糖凝膠電泳，按分子量大小分離后，轉移至尼龍濾膜上，然后將已標記的小衛星DNA探針與膜上具有互補堿基序列的DNA片段雜交，用放射自顯影獲得DNA指紋圖譜。

4.2 多重PCR結合微陣列技術

多重PCR從單一反應中一次性檢測到多個目的基因，減少了反應次數。但多重PCR反應的引物、探針設計難度較大。此外，多重PCR的承載量還受到發射光和吸收光光譜的限制，因為不同熒光的組合會增加熒光的背景，影響結果的判定，且重疊信號是不能被使用的。目前為止，最多可以實現六個熒光信號成功的標記在同一個反應中。在多重PCR反應的基礎上再結合基因芯片的方法，就可以達到高通量檢測的目的［24-25］。基因芯片（gene chip），是一塊帶有DNA微陣列（micorarray）涂層的特殊玻璃片，在數平方厘米之面積上安裝數千或數萬個核酸探針，經由一次測驗，即可提供大量基因序列相關資訊。研究人員應用基因芯片就可以在同一時間定性、定量的分析大量（成千上萬個）的基因表達的水平，具有快速、精確、低成本之生物分析檢驗能力［26-27］。

4.3 第三代測序技術

2008年，美國Harris等發明了一種單分子測序技術，并成功對M13病毒的基因組進行了重測序，因此也拉開了以單分子測序為標志第三代測序帷幕。目前，引領第三代測序的主要有通過檢測標記熒光獲得序列信息的Helicos的HeliScope遺傳分析系統和PacBio的SMRT技術，以及Oxford Nanopore公司的納米孔測序技術（Nanopore）等［28-30］。2011年春季在歐洲引起大量人死亡的大腸桿菌定性方面測序技術起了重要作用［31］，2015年也有文獻報道：測序技術有效識別未授權的GMO（高表達維生素B2的枯草芽孢桿菌）［32］。

4.4 數字PCR

數字PCR（Digital PCR-dPCR）技術是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統定量PCR （qPCR）技術不同，數字PCR采用絕對定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數。該方法的原理是將核酸模板進行稀釋，分配到大量獨立的反應空間中，理論上使每個空間中只有一個DNA，然后進行PCR擴增反應，擴增結束后對熒光信號進行統計學分析，來計算目的DNA拷貝數。數字PCR采用先擴增后定量，因此不依賴擴增曲線的循環閾值（Ct），準確度高、重現性好，實現了絕對定量分析。有研究表明：一次數字PCR反應中可以同時準確定量分析了8個不同的目標基因（包括7個轉基因玉米轉化事件和玉米內標準基因）［33］。

4.5 生物傳感器

轉基因作物的雜交品種（即堆疊式轉基因生物）因其生產效率的提高和功能的改善而日益流行，而堆疊式轉基因生物的檢測是一個亟待解決的難題。近年來，有研究表明：多標記的電化學生物傳感器可以同時檢測含多種轉基因成分的產品［34］。

4.6 替代PCR的前瞻性

考慮經濟效益，無論是高密度微陣列還是下一代測序都不適合于常規的轉基因檢測。然而，在不久的將來，這些技術將變得更便宜，對人員技能的要求也會降低，設備應用越來越廣泛。因此，替代和先進的工具逐漸將找到自己的方式，也為轉基因檢測提供新的技術手段。

5 展望

隨著轉基因技術的發展，新的基因編輯技術（如Talen 和CRISPR-cas9）和產品的出現，使轉基因的檢測和監測越來越困難。目前，轉基因成分檢測方法是主要以目的DNA為檢測對象的PCR技術。PCR擴增技術有兩個關鍵點：模板DNA的質量和引物的特異性。隨著轉基因產品加工技術水平和加工精度的提高，模板DNA在加工過程中破壞更為嚴重，加工過程引入的物理、化學或生物性的PCR反應抑制因子，給轉基因檢測帶來了困難。因此，為提高轉基因成分檢測的特異性及靈敏度，需大力發展復雜樣品的核酸提取和純化技術，同時也應發展特異性和靈敏度更高、重復性更好、檢測更快速、結果更可靠的新型核酸檢測技術，如高通量測序技術。隨著轉基因產品商業化加快，要求在短時間內同時完成大量樣品的各種轉基因成分檢測，因此，高通量、自動化、微型化、低成本、高靈敏度、高特異性、快速簡便、準確高效的轉基因檢測技術及技術組合將是未來轉基因檢測技術研究與應用的發展方向。

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（責任編輯 楊賢智）

Research progress detection methods of genetically modified organisms（GMOs）

LI Xia-ying，ZHANG Xiu-jie，SONG Gui-wen
（Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture，Beijing 100176，China）

With the rapid application and development of transgenic technology in agriculture，the categories and quantities of transgenic products progressively increased，the safety of genetically modified organisms （GMOs）has attracted more and more extensive concern of the public. Accordingly，it is very urgently needed constant innovation and development for the transgenic detection technique systems. The article briefly reviewed the common detection technology and method of GMO，especially the un-authorized GMO both in China and abroad，the existing primary detection technology and method of GMO mainly based on detection of exogenous protein and nucleic acid，such as ELISA，PCR，isothermal amplification technology and so on，there were also a number of new technologies such as fingerprint identification，microarray，high-throughput sequencing. The paper may have some inspiration to the safety management of genetically modified organisms in our country.

GMO；bio-safety；detection method；genotype；PCR

Q785

A

1004-874X（2017）02-0032-07

2016-10-09

李夏瑩（1986-），女，博士，農藝師，E-mail：esmacloed006@163.com

宋貴文（1965-），男，高級農藝師，E-mail：songguiwen@agri.gov.cn

李夏瑩，張秀杰，宋貴文. 轉基因生物檢測方法研究進展［J］.廣東農業科學，2017，44（2）：32-38.