雷帕霉素干預對左旋多巴誘發的異動癥大鼠行為學的影響

張丙天，陳志斌，陳小武，繆茂軍，何曉闊，曹學斌

雷帕霉素干預對左旋多巴誘發的異動癥大鼠行為學的影響

張丙天，陳志斌，陳小武，繆茂軍，何曉闊，曹學斌

目的 研究雷帕霉素干預對左旋多巴誘發的異動癥(LID)的行為學的影響。方法 通過6-羥基多巴胺顱內立體定向注射制作偏側大鼠帕金森病模型。給予左旋多巴腹腔注射1周制作LID大鼠模型。將LID大鼠分為LID對照組(LID組)和雷帕霉素干預觀察組(RAPA組)。繼續左旋多巴腹腔注射2周，RAPA組大鼠每天于左旋多巴注射前45 min腹腔注射雷帕霉素，低劑量0.25 mg/(kg·d)、中劑量0.35 mg/(kg·d)、高劑量0.5 mg/(kg·d)，每周注射4 d，持續2周。對照組同時給予等體積生理鹽水腹腔注射。記錄大鼠異常不自主運動(AIM)評分并對比分析。結果 RAPA低劑量亞組未觀察到有意義的行為學改變；RAPA高劑量亞組在雷帕霉素給藥后數天出現精神萎靡、食欲減退、血尿等癥狀，5～10 d左右逐漸死亡，經尸體解剖及病理切片發現，動物死亡原因與肺炎、肝腎損害等原因密切相關。RAPA中劑量亞組行為學改變比較理想，且動物耐受性較好，沒有出現死亡。RAPA干預治療開始起，RAPA中劑量亞組大鼠每天AIM評分均較LID組大鼠明顯降低(均P<0.05)。左旋多巴注射第20 d，RAPA中劑量亞組大鼠左旋多巴治療后120 min 內AIM評分均較LID組大鼠明顯降低(均P<0.05)。結論 雷帕霉素治療能顯著改善LID大鼠行為學表現，改善LID大鼠不自主運動癥狀。

帕金森病；左旋多巴誘發的異動癥；雷帕霉素；行為學

研究[1]表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路和左旋多巴誘發的異動癥(LID)的發生相關。其上游的一種小型G蛋白Rhes基因可以激活mTOR信號通路。在LID動物模型中，缺乏Rhes基因的小鼠表現出異動癥狀會得以減輕[2]。活化的mTOR激活其下游兩個重要的靶蛋白：核糖體S6蛋白激酶(s6kinase，p70S6K，S6K)和真核細胞始動因子4E結合蛋白(4E-BP1)活化后可促進核糖體蛋白質翻譯，調節蛋白的合成。4E-BP1通常與真核細胞始動因子4E(elF-4E)結合并抑制其括性，進而抑制翻譯的開始。當活化的mTOR將4E-BP1磷酸化后，解除elF-4E/4E-BP1的結合，促進帽子結構依賴性翻譯的起始，進而調控蛋白質的合成。在6-羥基多巴胺(6-OHDA)制作的帕金森病(PD)的小鼠模型中，雷帕霉素可以實現抗運動障礙效應，mTOR抑制劑CCI-779能夠改善LID大鼠的行為學表現[3]。為證實雷帕霉素在大鼠LID模型的抗運動障礙效應，本研究以6-OHDA立體定位注射制備偏側PD大鼠模型，給偏側PD大鼠模型腹腔注射左旋多巴胺+芐絲肼制作LID模型，同時用雷帕霉素對LID大鼠模型進行干預，觀察LID大鼠經雷帕霉素治療后的行為學變化，為進一步探討LID發病機制和藥物治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 普通級Sprague-Daewley 大鼠，由武漢大學實驗動物中心提供，體質量200～220 g，雄性。實驗期間，保持動物房良好通風，室溫在24℃左右，相對濕度40%～70%，12 h照明12 h黑暗，動物自由進食，自由飲水。

1.1.2 主要藥品與試劑 水合氯醛(固體)為國藥控股公司產品，6-OHDA、阿樸嗎啡、左旋多巴甲酯、鹽酸芐絲肼均為sigma公司產品，雷帕霉素(DMSO溶解，-20°儲存)為cayman chemical公司產品。

1.2 方法

1.2.1 PD動物模型制備 大鼠經12 h以上禁食(不禁水)后稱重，7%水合氯醛0.05 ml/kg，腹腔注射麻醉。麻醉后固定于立體定向儀，剪去頭頂毛發，局部碘伏消毒，切開頭皮，刮開骨膜，30%雙氧水局部涂擦以充分顯露前囟。以前囟為原點確定坐標，以右側內側前腦束(MFB)為靶區立體定向注射6-OHDA制作偏側PD大鼠模型。鉆顱坐標：AP：-4.4 mm； ML：1.4 mm；DV：-7.8 mm，制作偏側PD大鼠模型。鉆開顱骨后，將針尖調至接觸硬腦膜，讀取硬腦膜高度并記錄，抽取4 μl 6-OHDA溶液，穿破硬腦膜，緩慢進針至硬腦膜下-7.8 mm處，按0.5 μl/min 速度向MFB注射[4]，注射完畢留針5 min，以1 mm/min緩慢退針，縫合皮膚，置籠飼養。手術2周后，按照0.05 mg/kg的劑量，阿樸嗎啡頸部皮下注射誘導動物向對側旋轉，5～10 min后，記錄每5 min旋轉次數，共30 min，大于平均7 r/min的大鼠作為成功PD大鼠模型。本實驗中PD大鼠造模成功率約75%。

1.2.2 LID模型制作及分組 給成功的PD大鼠模型每天腹腔注射左旋多巴 10 mg/kg +芐絲肼2.5 mg/kg，連續1周，制作LID模型。待大鼠出現異常不自主運動(AIM)表現，達到典型LID標準后(單日AIM評分≥16分)[5]，根據AIM評分，均衡分為LID對照組和雷帕霉素干預觀察組(RAPA組)。RAPA組又隨機分為低劑量亞組、中劑量亞組、高劑量亞組。自左旋多巴治療第2周開始，RAPA組大鼠每天于左旋多巴注射前45 min腹腔注射雷帕霉素，低劑量0.25 mg/(kg·d)、中劑量0.35 mg/(kg·d)、高劑量0.5 mg/(kg·d)，每周注射4 d，持續2周。對照組同時給予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.2.3 行為學觀察 各組大鼠于藥物注射后，參照文獻[5]報道的方法進行AIM 評分，評定左旋多巴治療后120 min 內AIM總分數，每30 min 1 次，共4次(其中第20 d每20 min 1 次，共6次)。將AIM 分為4個部分(上肢 AIM、 口面部 AIM、 軸性 AIM、運動AIM)進行評定。每部分又根據其有無和嚴重程度分5個等級(0～4分)：0=無；1=偶爾出現，<50%的時間；2=經常出現，≥50%的時間；3=持續存在，刺激能停止；4=持續存在，刺激不能停止。理論上1只大鼠1次用藥后每個評分時間點最大得分為16分，120 min最大評分為96分。

2 結 果

2.1 LID大鼠模型制作結果 挑選出合格的PD大鼠，經左旋多巴治療1周后，70%的動物出現AIM，行為學評分達到LID評分標準。PD大鼠AIM出現的時間不一，平均為(2±1)d，另外約30%的大鼠始終未出現AIM或AIM評分達不到LID評分標準。LID 的行為學改變主要表現為對側旋轉行為和刻板動作，如頭頸部和軀體向對側扭轉, 下頜及對側上肢的刻板舔吮動作，或對側上肢的節律性拍打、抖動等。這些現象在單次注射藥物后30～60 min達到高峰，持續2 h左右；治療全程中，5～7 d達到典型LID標準，2～3周達到高峰。

2.2 RAPA組大鼠行為學改變情況 經過觀察，RAPA低劑量亞組未觀察到有意義的行為學改變。RAPA高劑量亞組在雷帕霉素給藥后數天出現精神萎靡、食欲減退、血尿等癥狀，5～10 d左右逐漸死亡，經尸體解剖及病理切片證實，動物死亡原因與肺炎、肝腎損害等原因密切相關，其中肺炎尤其多見 (圖1～3)。RAPA中劑量亞組行為學改變比較理想，且動物耐受性較好，沒有出現死亡。

圖1 RAPA高劑量亞組大鼠肺組織石蠟切片示肺炎。A：大量中性粒細胞浸潤肺泡腔；B：肺泡腔內纖維素；C：肺水腫液及巨噬粒細胞；D：支氣管內可見大量水腫液(HE染色,×400)

圖2 RAPA高劑量亞組大鼠肝組織內可見局部片狀局灶性水樣變形(HE染色，×200) 圖3 RAPA高劑量亞組大鼠腎組織石蠟切片示部分腎小球增生，腎小管上皮細胞水樣變性，脫落，細胞核消失(HE染色，×200)

2.3 RAPA中劑量亞組與LID組大鼠AIM評分的比較 見表1、表2。左旋多巴注射第8 d起，即RAPA干預治療開始起，RAPA中劑量亞組大鼠每天AIM評分均較LID組大鼠明顯降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。左旋多巴注射第20 d，RAPA中劑量亞組大鼠左旋多巴治療后120 min 內6次AIM評分均較LID組大鼠明顯降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表1 左旋多巴注射后各時間點RAPA中劑量亞組與LID組大鼠AIM評分的比較(x±s)時間LID組RAPA中劑量亞組第1d16.6667±4.457214.6667±12.3720第3d20.8333±6.369222.0000±10.2372第5d29.1667±5.741728.8333±10.0083第7d37.5000±9.669537.0000±16.1493第8d43.0000±8.221923.0000±6.4807*第10d43.3333±7.966617.8333±15.0654*第12d53.3333±20.752518.0000±17.6862*第14d44.3333±7.685531.0000±10.9362*第16d51.1667±8.975925.3333±9.8725*第18d48.1667±21.627919.5000±9.8944*第20d53.8333±12.254323.1667±10.8520* 注:與LID組同時間點比較*P<0.05

表2 第20d左旋多巴注射后各時間點RAPA中劑量亞組與LID組大鼠AIM評分的比較(x±s)時間LID組RAPA中劑量亞組第20min9.5000±2.73864.1667±2.6394*第40min14.5000±1.76077.6667±2.0332*第60min15.5000±1.76077.6667±2.0332*第80min15.3333±4.26116.0000±1.4059*第100min15.3333±4.26116.0000±1.4059*第120min4.6667±1.36632.5000±0.4736* 注:與LID組同時間點比較*P<0.05

3 討 論

雷帕霉素是mTOR特異性抑制劑。最初，雷帕霉素作為低毒性抗真菌抗生素，后來發現它對自身免疫性疾病有免疫抑制作用，因而又被作為動物實驗及臨床應免疫抑制劑使用[6-7]。mTOR與細胞增殖和凋亡關系密切，其異常活化與多種人類腫瘤的發生發展有關，也被廣泛運用于腫瘤疾病的研究[8-9]。進一步研究[10-11]發現，雷帕霉素通過抑制mTOR，促進自噬，對神經退行性疾病有治療作用及神經保護作用，能延緩諸如Alzheimer’s病和PD之類的神經退化性疾病的發展，因而為神經科所重視。

研究[12-13]顯示，由于能夠阻斷RTP801/REDD1/Ddit4的翻譯表達，在細胞試驗和神經毒劑毀損制作的PD模型中，雷帕霉素都表現出了保護神經而使其免于死亡的效果，被認為對許多神經退行性疾病都有肯定的作用。本研究發現，左旋多巴注射第8 d起，即RAPA干預治療開始起，RAPA中劑量亞組大鼠每天AIM評分均較LID組大鼠明顯降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。左旋多巴注射第20 d，RAPA中劑量亞組大鼠左旋多巴治療后120 min 內6次AIM評分均較LID組大鼠明顯降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。說明雷帕霉素能有效減輕LID大鼠AIM的嚴重程度，而且已經產生的異動癥也有望經過雷帕霉素治療得以減輕。雷帕霉素治療LID的價值有待更多的實驗研究予以證實，其治療機制也有待進一步深入探索。

雷帕霉素的水溶性極差，且性質不穩定。關于雷帕霉素的給藥途徑，根據動物種屬和研究目的不同，文獻[14-17]報道的方法主要有顱內置管、腹腔注射、灌胃、皮下注射等方法，劑量從1 μg/kg～20 mg/kg不等。但結合本研究特點，綜合考慮實驗效率、性價比、藥代動力學等因素，腹腔注射是比較合適的給藥途徑。至于給藥劑量，有學者[15]在實驗中使用2 mg/kg的劑量，但據本實驗證實，大于0.5 mg/kg的劑量，大鼠并不能很好的耐受，不適宜較長時間給藥，尤其對于需要長期觀察行為學的動物實驗。藥物劑量過高，動物不能耐受；劑量過低，不能實現有意義的行為學改變，均達不到理想的實驗效果。除此之外，還有研究[18-19]發現，雷帕霉素能激活胰島素受體底物蛋白1，使實驗動物出現糖耐量減低、機體胰島素敏感性下降、胰島素分泌功能受損、胰島素抵抗現象。這也可能給動物生存造成一定的影響，本研究鑒于時間因素，暫未行進一步探討。不同種屬動物之間吸收存在很大的差異。由于雷帕霉素半衰期比較長，再加上大鼠解剖結構中沒有膽囊，所有藥物全須經肝腎代謝，這就增加了肝腎毒性風險。本研究結果發現，大鼠給予雷帕霉素后肝腎毒性多見，推測這是大鼠的雷帕霉素耐受量和小鼠有明顯差異的主要原因之一。

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Effect of Rapamycin treatment on the behavioristics of levodopa induced dyskinesia rats

ZHANGBing-tian,CHENZhi-bin,CHENXiao-wu,etal.

DepartmentofNeurologicalRehabilitation,ShiyanTaiheHospitalofHubeiProvince(TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalCollege),Shiyan442000,China

Objective To evaluate the effect of Rapamycin treatment on the behavioristics of levodopa induced dyskinesia (LID) rats. Methods Hemi-parkinsomism rat models were made by 6-hydraxydopamine microinjection stereotaxically into medial forebrain bundle. Then LID rat models were established by intraperitoneal injection of levodopa for a week. The LID rats were randomly divided into the LID control group (LID group) and Rapamycin treatment observation group (RAPA group). Then all of the rats were treated with levodopa by intraperitoneal injection for 2 weeks, and the rats in RAPA group were treated with Rapamycin by intraperitoneal injection 45 min before levodopa injection, with low dose of 0.25 mg/(kg·d), middle dose of 0.35 mg/(kg·d) and high dose of 0.5 mg/(kg·d), 4 d a week for 2 weeks. The control group was given the same volume of normal saline. The abnormal involuntary movement (AIM) scores of rats were ecorded and analyzed. Results There was no significant behavior changes recorded in RAPA low dose subgroup. Rats in RAPA high dose subgroup appeared some problems such as listlessness, loss of appetite and hematuria after administration of Rapamycin for a few days, and died in about 5-10 d. The autopsy and pathologic diagnosis approved that the animals died due to pneumonia, liver and kidney function damage. The behavioral changes in RAPA middle dose subgroup were satisfying, and the animals showed well tolerance without rats died. After RAPA treatment, the dayly total AIM scores of the rats in RAPA middle dose subgroup were significantly lower than that in LID group (allP<0.05). The AIM scores of the RAPA middle dose subgroup within 120 min at 20 d after levodopa treatment were significantly lower than LID group (allP<0.05). Conclusion Rapamycin therapy can significantly improve the behavioral performance of LID rats, improve the involuntary movement symptoms of LID rats.

Parkinson’s disease；levodopa induced dyskinesia;Rapamycin；behavioristics

國家自然科學基金(31260241)

442000湖北省十堰市太和醫院(湖北醫藥學院附屬太和醫院)神經康復科(張丙天，何曉闊)；江蘇省寶應縣人民醫院神經內科(繆茂軍)；海南醫學院附屬醫院神經內科(陳小武，陳志斌)；華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院神經內科(曹學斌)

陳志斌

R742.5

A

1004-1648(2017)02-0116-04

2016-03-29

2016-05-09)