基于適體生物傳感器的堿性磷酸酯酶化學(xué)發(fā)光檢測腺苷

嚴(yán)喜鸞，陳 馨，肖義陂，劉 杰

(1.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西 南昌 330031；2.南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330008；3.南昌大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330031)

基于適體生物傳感器的堿性磷酸酯酶化學(xué)發(fā)光檢測腺苷

嚴(yán)喜鸞1，陳 馨1，肖義陂2，劉 杰3*

(1.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西 南昌 330031；2.南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330008；3.南昌大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330031)

制備了一種可用于腺苷檢測的適體生物傳感器，以羧基磁性微球為載體，在其表面組裝腺苷適體與地高辛修飾之腺苷適體互補的核酸短鏈，先加入一定濃度的腺苷，再連接抗地高辛的堿性磷酸酯酶，用化學(xué)發(fā)光法檢測發(fā)光值，根據(jù)腺苷加入前后化學(xué)發(fā)光強度的變化來定量檢測腺苷。實驗考察了羧基磁性微球用量、氨基修飾的腺苷適體用量、地高辛修飾的核酸短鏈用量及抗地高辛的堿性磷酸酯酶用量對體系組裝和腺苷識別的影響。結(jié)果顯示，優(yōu)化條件下，在1.0×10-7～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，腺苷濃度的對數(shù)與發(fā)光信號呈線性關(guān)系(r2=0.976 9)，定量下限為1.0×10-7mol/L。與其他核苷相比，腺苷的選擇特異性更好，且在稀釋血清中適體對腺苷有很好的特異性識別能力。

適體；磁性微球；腺苷；化學(xué)發(fā)光

適體是一種通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)體外合成、可特異性識別相應(yīng)目標(biāo)物的寡核苷酸鏈，其目標(biāo)物包括小分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、病毒、細(xì)菌等，常作為生物傳感器的識別元件[1-3]。適體與目標(biāo)物之間的親和力高，其解離常數(shù)在1.0×10-9～1.0×10-12mol/L之間，已有較多文獻(xiàn)表明腺苷適體與腺苷的結(jié)合力大于腺苷適體與配對DNA鏈的雜交結(jié)合力[4-6]。近年研究基于適體生物傳感器可實現(xiàn)反應(yīng)物、催化劑、增敏劑、抑制劑等的高靈敏檢測[7]。磁性微球作為載體可以實現(xiàn)快速分離，常作為生物傳感器的固定材料[8]。利用適體對目標(biāo)物的特異性識別能力[9-10]，結(jié)合化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence,CL)法[11],在磁性微球上固定地高辛修飾的寡核苷酸鏈后，利用地高辛-抗地高辛的特異性結(jié)合[12]，可將抗地高辛堿性磷酸酯酶固定到磁性微球上，構(gòu)建化學(xué)發(fā)光適體生物傳感器。

腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷，可直接進(jìn)入到心肌形成腺嘌呤核苷酸參與心肌能量代謝，其濃度與擴張冠狀動脈血管的程度呈正相關(guān)，它能夠控制血管平滑肌的收縮，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，可用于快速心律失常和局部缺血的診斷和治療；此外，腫瘤細(xì)胞快速生長導(dǎo)致細(xì)胞缺氧壞死，其腺嘌呤核苷酸降解為腺苷，腺苷濃度的升高，在一定程度上可作為與癌癥相關(guān)的生物標(biāo)記物，因此對腺苷的簡單、快速檢測在臨床診斷中具有重要意義[13-14]。目前檢測腺苷的常用方法包括高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳和免疫層析結(jié)合的熒光檢測法、質(zhì)譜分析等[15-19]。

本文以腺苷作為目標(biāo)分子，制備了可特異性識別腺苷的適體生物傳感器，利用堿性磷酸脂酶的化學(xué)發(fā)光對腺苷進(jìn)行定量檢測，發(fā)展了一種快速、靈敏檢測腺苷的技術(shù)，具有良好的應(yīng)用前景，為腺苷及其他物質(zhì)的檢測提供了新思路。與其他檢測方法相比，其檢測范圍寬、靈敏度較高、步驟簡單、檢測周期較短。與利用辣根過氧化物酶檢測腺苷的方法[20]相比，提高了實驗穩(wěn)定性，更利于實際應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HZ-9211K恒溫振蕩器(太倉市科教器材廠)；CS15000磁性分離器(美國Invitrogen公司)；UPHW-111-90T純水裝置(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；Fluoroskan Ascent 96孔板化學(xué)發(fā)光儀。

羧基磁性微球(直徑1.5 μm，20 mg/mL，M-COOH,美國Polyscience公司)；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺 (EDC，法國 Johnson Matthey公司)；抗地高辛修飾的堿性磷酸酯酶(Anti-digoxin-ALP,1.2 mg protein/mL，美國Sigma-Aldrich公司)；ALP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國Millipore公司);腺苷、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、牛血清白蛋白(BSA)購于上海愛紫特公司；咪唑、Tween 20(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);核苷酸序列由上海生工生物有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備固定有腺苷適體的生物傳感器 ①取40 μg羧基修飾的磁性微球于1.5 mL離心管中，以咪唑緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.0)洗滌3次，加入含EDC的咪唑緩沖液懸浮磁性微球，37 ℃恒溫振蕩活化20 min；②加入1.5 pmol氨基修飾的腺苷適體，37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)1 h；③磁性分離移去上清液，WB清液緩沖液(7 mmol/L Tris，0.17 mol/L NaCl,0.05%Tween 20，pH 8.0)清洗磁性微球3次，加入10%BSA 溶液，37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)1 h；④加入60 fmol地高辛修飾的報告序列，25 ℃恒溫振蕩器反應(yīng)1 h，磁性分離移去上清液，WB清液緩沖液洗滌3次，即制備好固定有腺苷適體的生物傳感器。

1.2.2 化學(xué)發(fā)光檢測 ①配制不同濃度的腺苷溶液，加入上述生物傳感器,25 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)1 h；②磁性分離移去上清液，用含有 2%BSA的WB清液緩沖液洗滌3次，加入含有2%BSA的抗地高辛堿性磷酸酯酶的BA緩沖液(20 mmol/L Tris,0.5 mol/L NaCl，pH 8.0)，25 ℃下孵育1 h；③磁性分離移去上清液，WB清液緩沖液洗滌3次，移至Fluoroskan Ascent 96孔板中，用八通道移液器同時加入ALP酶底物檢測試劑盒溶液進(jìn)行CL測定。CL信號由系統(tǒng)自帶的工作站Ascent Software Version 2.6顯示并記錄，以信號最高值后10 s的積分值作為最終信號值。實驗原理見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的優(yōu)化

對實驗進(jìn)行了初步探究：首先，在不加腺苷適體的情況下，加入磁性微球、腺苷和地高辛修飾的短鏈DNA，實驗步驟同示意圖，測得其信號值極低，幾乎等同于空白背景信號值，說明地高辛修飾的短鏈DNA不會由于非特異吸附到磁性微球上而增加背景信號值。其次，在不加腺苷的基礎(chǔ)上，加入一定量的報告序列，對不同用量(0.2～1.8 pmol)的適體作線性范圍考察。在50 fmol的報告序列用量下，加入腺苷適體的量與CL信號值有良好的線性關(guān)系，由此在線性范圍的中段選取適體用量進(jìn)行實驗，這也為進(jìn)一步優(yōu)化適體用量以及報告序列用量研究奠定了基礎(chǔ)。隨后詳細(xì)考察了反應(yīng)所用羧基磁性微球、氨基修飾的適體、報告序列以及抗地高辛-ALP的量對CL信號的影響。

圖1 腺苷的化學(xué)發(fā)光檢測示意圖Fig.1 Schematic presentation of adenosine chemiluminescent analytical protocol

2.1.1 羧基磁性微球的用量 考察了羧基磁性微球用量(20，30，40，50，60，80 μg)對CL信號值的影響。結(jié)果顯示，羧基磁性微球用量為40 μg時，CL信號值最大，之后信號隨其用量的增加反而下降，這是由于過量的磁性微球雖然為氨基適體增加了連接位點，但磁性微球量的增多對發(fā)光信號有吸收，反而使CL信號值降低，故實驗選擇40 μg為羧基磁性微球的最佳用量。

圖2 氨基修飾的腺苷適體量的優(yōu)化選擇(n=3)Fig.2 Optimal selection of amount of amino modified adenosine aptamer(n=3)

2.1.2 腺苷適體的用量 考察了不同的氨基修飾腺苷適體用量(1.0，1.5，3.0，8.0，10 pmol)對CL信號值的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)腺苷適體用量為1.5 pmol時，CL信號值最大，之后隨其用量增加反而下降，這是由于隨著氨基適體量的增加，羧基磁性微球上連接的適體也增多，增大了空間位阻，導(dǎo)致結(jié)合的報告序列量減少，降低了CL信號值，故實驗選擇1.5 pmol為腺苷適體的最佳用量。

2.1.3 報告序列的用量 考察了報告序列用量(20，30，40，60，80 fmol)對CL信號值的影響，結(jié)果顯示，在10～60 fmol時，CL信號隨報告序列用量的增加而急劇增加，60 fmol時CL信號值達(dá)到最高值，之后隨著報告序列用量的增加，CL信號反而下降。這是由于適體量是固定的，當(dāng)報告序列的用量達(dá)到與適體結(jié)合的飽和點后，過多的報告序列反而會影響適體與報告序列的結(jié)合，導(dǎo)致CL信號值下降，故實驗選擇60 fmol為報告序列的最佳用量。

2.1.4 抗地高辛-ALP酶的稀釋倍數(shù) 考察了不同稀釋倍數(shù)的抗地高辛-ALP酶的用量(1∶3 000～1∶12 000)對CL信號值的影響，結(jié)果顯示，在1∶5 000的稀釋倍數(shù)條件下，CL信號值達(dá)到最大。在高于1∶5 000稀釋倍數(shù)用量中，信號有較大幅度的降低。說明過量的抗地高辛-ALP酶不利于CL的檢測，故實驗選擇1∶5 000稀釋倍數(shù)為抗地高辛-ALP酶的最佳用量。

2.2 線性范圍與檢出限

在上述優(yōu)化實驗條件下，對腺苷進(jìn)行檢測，在1.0×10-7～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，腺苷濃度的對數(shù)與發(fā)光信號呈線性關(guān)系，線性方程為y=10 571 lgx+5 857 (r2=0.976 9)，最低檢出濃度為1.0×10-7mol/L。對1.0×10-6mol/L腺苷平行測定6次，得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為(RSD)4.5%。

圖4 在稀釋血清中腺苷的檢測(n=3)Fig.4 Detection of adenosine in a diluted human serum with buffer solution(n=3))

2.3 選擇性考察

選取濃度均為1.0×10-3mol/L的鳥苷、尿苷和胞苷與腺苷，在同樣的優(yōu)化檢測條件下進(jìn)行選擇性考察，結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出腺苷適體對腺苷的識別能力強于其他核苷的識別能力，且信號略高于各核苷混合后反應(yīng)的信號，可能是由于其它核苷占據(jù)了腺苷適體與腺苷的結(jié)合位點，從而降低了對腺苷的結(jié)合效率，進(jìn)一步表明該檢測方法具有高特異性。

2.4 血清中腺苷的檢測

取緩沖液和緩沖液稀釋的10%、50%血清，分別與濃度為5.0×10-5mol/L 和5.0×10-6mol/L的腺苷進(jìn)行混合，結(jié)果如圖4所示。與緩沖液中反應(yīng)結(jié)果相比，血清稀釋液中CL信號降低近一半，推測是血清中其它蛋白占據(jù)適體上的結(jié)合位點，影響適體對目標(biāo)分子的特異性識別能力。盡管降低幅度較大，但信號明顯且誤差較小，該方法可用于血清中微量腺苷的實際測定[21]。

2.5 與其他方法的比較

經(jīng)與其他方法對比分析發(fā)現(xiàn)(表1)，該方法的檢測范圍更寬，且該法利用堿性磷酸酯酶化學(xué)發(fā)光法檢測腺苷，穩(wěn)定性更高，簡化了實驗操作，更有利于實際應(yīng)用。

表1 不同檢測腺苷方法的比較Table 1 Comparison of different analytical methods for detection of adenosine

LC-APCI-MS/MS：liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry/mass spectrometry;HPLC：high performance liquid chromatography

3 結(jié) 論

本文將腺苷適體和互補的地高辛核酸鏈依次固定在磁性微球上，通過地高辛-抗地高辛特異性結(jié)合反應(yīng)，將抗地高辛修飾的堿性磷酸酯酶組裝到磁性微球上，構(gòu)建了一種酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光檢測適體傳感器，并用于腺苷的檢測。研究結(jié)果顯示，該方法的靈敏度高、簡單方便，為其他物質(zhì)的快速檢測提供了良好思路。

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Detection of Adenosine Based on Aptamer Biosensor with Alkaline Phosphatase Chemiluminescence Assay

YAN Xi-luan1,CHEN Xin1,XIAO Yi-bei2,LIU Jie3*

(1.School of Resources,Environmental & Chemical Engineering,Nanchang University,Nanchang 330031,China；2.Hongdu Traditional Chinese Medical Hospital,Nanchang 330008,China；3.School of Pharmacy,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

A kind of aptamer biosensor was prepared to detect adenosine,with magnetic microspheres as the carrier immobilizing adenosine-binding aptamer,then assembling adenosine aptamer-digoxin labeled part-complementary strand of adenosine-binding aptamer(report DNA) on the surface.After adding adenosine,the anti-digoxin alkaline phosphatase(ALP)reacted with it,which could result in a change of chemiluminescence(CL) signal.Adenosine was quantified according to the change of the CL intensity.Factors affecting the assembly and recognition process,including amount of magnetic microsphere,aptamer,report DNA and ALP labeled anti-digoxin, were studied.The results showed that under the optimal conditions,the concentration of adenosine was linear to CL intensity in the range of 1.0×10-7-1.0×10-3mol/L with a detection limit of 1.0×10-7mol/L.The result showed that this method had a better specificity to adenosine than other nucleosides,and was capable of selectively detecting quantities of adenosine in a complex environment(serum).

aptamer；magnetic microsphere；adenosine；chemiluminescence

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.022

2016-11-10；

2016-12-22

國家自然科學(xué)基金項目(31660491，81102289)；江西省自然科學(xué)基金項目(20142BAB216033，20132BAB205106)

O657.3；Q525

A

1004-4957(2017)04-0565-05

*通訊作者：劉 杰，講師，研究方向：生物免疫分析及納米材料，Tel：13576079746，E-mail：Liujiesunny@126.com