不同擠壓壓力與大鼠擠壓傷嚴重程度的相關性

王 鑫，呂 琪，丁 輝，劉子泉，曾喜歡，王 敬，侯世科

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不同擠壓壓力與大鼠擠壓傷嚴重程度的相關性

王 鑫1，2，呂 琪2，丁 輝2，劉子泉2，曾喜歡2，王 敬2，侯世科2

目的初步探討不同擠壓壓力與大鼠擠壓傷嚴重程度的相關性。方法將127只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組（15只）、模型組（56只）、治療組（56只）。模型組和治療組大鼠均分別用3 kg及5 kg壓力擠壓雙下肢16 h，治療組于解壓前1 h給予常規無菌生理鹽水補液治療，1 ml/（kg·h），至解壓后6 h完成補液。留取造模或治療后24 h、72 h血液樣本及肌肉組織樣本進行血生化及濕干重比檢測；留取72 h各組組織樣本進行組織病理學評估；記錄各組72 h生存率。結果模型組大鼠解壓24 h后血生化指標鉀離子（potassium ions，K+）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）均升高，與對照組比較（P＜0.001）；與3 kg壓力組比較，5 kg壓力組血清各指標水平均升高顯著（P＜0.01）。5 kg壓力組可觀察到大片橫紋肌溶解、廣泛的腎小管管型，遠隔器官肺組織出現局灶性炎性細胞浸潤及肺泡間隔增厚，但肌肉水腫及72 h生存狀況兩組之間無差異；給予常規補液治療后，兩不同壓力組血生化指標變化不大，但病理損傷減輕，腎小管管型減少；5 kg 壓力組未觀察到大范圍肌細胞壞死溶解、肺泡間隔增厚，炎性細胞滲出亦減輕，但其死亡率并未改善。而與模型組相比，3 kg壓力組死亡率減少（P=0.047）。補液后由于灌注量增加，肌肉濕干重比也隨之增加。結論在一定范圍內擠壓傷嚴重程度與擠壓壓力呈正相關。

擠壓傷；不同擠壓力；損傷嚴重程度；補液治療

擠壓傷（crush injury, CI）/擠壓綜合征（crush syndrome, CS）是由于肌肉組織豐富的部位，如雙下肢骨骼肌，受到外力長時間擠壓，在解除壓迫后形成的以低血容量性休克和急性腎損傷為代表的橫紋肌溶解綜合征[1]。地震、交通事故、昏迷等均可導致CI，甚至CS。由于震中建筑物材料各式各樣，環境復雜，導致CI/CS的擠壓力度各不相同，擠壓壓力與擠壓傷嚴重程度之間是否存在相關性目前還不清楚。本研究利用兩種不同壓力擠壓大鼠雙下肢，觀察大鼠各項指標變化，初步評價壓力與擠壓傷之間的相關性，并給予常規補液治療，觀察其對不同壓力所致擠壓傷的療效。

1 材料與方法

1.1實驗動物 26周齡、無特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級雄性健康Wistar大鼠127只，體重（250±30）g/只，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心[生產許可證號：SCXK-(軍)-2012-0004]；飼養條件：環境清潔，溫度（24±2）℃，濕度55%～65%，每籠8只，自由食水；購買后適應環境至少3 d，然后開始實驗。

1.2主要儀器與試劑 全自動血生化分析儀（日立7180）；TP1020半自動臺式組織脫水機、EG1150石蠟包埋機、RM2245半自動輪轉式切片機（Leica公司，德國）；生理鹽水（辰欣藥業股份有限公司）。

1.3分組及給藥 127只大鼠隨機分成對照組（15只）、模型組（56只）、治療組（56只）。模型組與治療組大鼠按擠壓力的不同再隨機分成3 kg壓力組（28只）和5 kg壓力組（28只）。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，初始劑量為3 ml/kg，擠壓期間為每1.5 h腹腔注射0.6 ml/kg，直至擠壓結束。麻醉后俯臥位置于鼠板上，四肢無其他任何固定，利用新一代數字化擠壓平臺（可精確設定擠壓重量）擠壓雙下肢，擠壓時間為16 h。模型組大鼠解壓后放回鼠籠自由食水，治療組大鼠于解壓前1 h，即擠壓15 h時尾靜脈置管，經微量泵進行常規無菌生理鹽水補液治療，補液速度為1 ml/（kg·h），解壓后放回鼠籠繼續補液，直至解壓后6 h完成補液。解壓后兩壓力組大鼠再次分為24 h（8只）及72 h（20只）兩個時間點進行指標觀察。對照組未做任何處理。

1.4樣本收集與檢測 （1）血生化指標檢測：各組大鼠于解壓后24、72 h腹腔注射過量戊巴比妥鈉深麻醉處死，經下腔靜脈收集3 ml血液標本，立即放入促凝管，常溫靜置15 min后離心（3000 r/min，15 min），吸取上清液利用全自動血生化分析儀進行分析，檢測指標包括鉀離子（potassium ions，K+）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）。

（2）肌肉濕干重檢測：于解壓后24 h、72 h留取擠壓部位肌肉，生理鹽水涮洗2次，紗布蘸干，電子天平稱重記錄濕重，而后放入65℃烘箱烘干，直到重量不再減輕，記錄干重，計算濕干重比。

（3）組織病理學檢測：解壓后72 h，留取擠壓部位肌肉、腎及肺組織，生理鹽水清洗2次，紗布蘸干，4%福爾馬林溶液浸泡固定（至少24 h），常規脫水、包埋、切片及蘇木精—伊紅染色法（ hematoxylin-eosin staining，HE）染色，顯微鏡下觀察評估并采集圖像。

（4）生存率：大鼠解壓后繼續觀察72 h，統計各壓力組生存狀況，制作生存曲線。

1.5統計學處理 應用SPSS 20.0進行統計分析，計數資料以頻數和率描述，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以描述，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗，不符合方差齊性或正態性資料采用非參數檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗比較各組間生存率差別。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1血生化指標變化 模型組解壓后24 h，3 kg組K+水平與對照組無明顯差異（P=0.664），而5 kg組K+升高明顯，與對照組及3 kg組相比，差異有統計學意義（P＜0.001），且常規補液治療可降低其K+濃度（t=2.410，P=0.047）。模型組CK、BUN、Cr解壓后24 h兩壓力組均明顯升高，尤其是5 kg組，其與3 kg組相比有統計學意義（P＜0.05）。補液治療后未明顯改善兩組該三項指標變化，反而使3 kg組有升高趨勢。ALT、AST于解壓后24 h與對照組相比，明顯升高（P＜0.01），但不同壓力組間差異不明顯，補液治療也未見改善（表1、表2）。解壓72 h后，各組血生化指標基本回落至正常范圍（表1、表3）。

2.2生存率變化 對照組大鼠全部存活（100%）；模型3 kg組死亡7只（65%），與對照組比較，差異有統計學意義（χ2=6.244，P=0.013）；模型5 kg組死亡6只（70%），與對照組比較，差異有統計學意義（χ2=5.182，P=0.023）；而模型組中兩不同壓力組間生存率無差異（χ2=0.077，P=0.781），但兩組生存曲線存在交叉，說明混雜因素較多，需要進一步實驗驗證。治療3 kg組死亡2只，生存率為90%，與對照組間的差異消失，與未治療的模型3 kg組相比，差異有統計學意義（χ2=3.940，P=0.047）；5 kg組死亡5只，生存率為75%，與模型組5 kg組比較，無明顯改善（χ2=0.198，P=0.656，圖1）。

2.3濕干重比 模型組解壓后擠壓部位肌肉出現明顯水腫，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01，圖2），但兩不同壓力組間比較，差異無統計學意義（P=0.200，表1)。模型3 kg組于解壓后72 h基本恢復到對照組水平（表1）。補液治療后，各組水腫程度加重，與各相應模型組相比，差異有統計學意義，而不同壓力組間差異仍無統計學意義（表2、表3）。

表2 解壓后24 h模型組與治療組血生化指標及濕干重比變化情況

表3 解壓后72 h模型組與治療組血生化指標及濕干重比變化情況

圖1 解壓后72 h生存曲線

圖2 下肢肌肉濕干重比

2.4組織病理學變化 如圖3所示，對照組大鼠肌肉肌纖維排列整齊，無斷裂，無充血及炎性細胞浸潤現象。腎小球結構完整，腎小管上皮細胞無脫落及變性壞死，無腎小管管型形成。肺泡結構完整，無間隔增厚及充血，無炎性細胞浸潤。

模型組解壓后72 h，大鼠肌肉水腫，肌纖維斷裂、排列紊亂，其中3 kg組肌纖維間充血、出血明顯，出現散在的炎性細胞滲出，而5 kg組局部肌細胞核固縮消失，可觀察到大片橫紋肌溶解壞死及大量炎性細胞浸潤。在給予補液治療后，肌肉水腫加重，5 kg組未觀察到大片橫紋肌溶解，組織間炎性細胞浸潤也明顯改善（圖3A）。

模型3 kg組大鼠腎小球充血水腫，可以觀察到較多量的腎小管管型，腎小管上皮細胞水腫變性，并存在散在炎性細胞滲出；模型5 kg組大鼠腎小管充血不明顯，而腎小管管型進一步增多，廣泛分布于腎臟皮、髓質，腎小管擴張，上皮細胞空泡變性，壞死脫落，部分腎小管基底膜破壞，同樣可以觀察到散在炎性細胞浸潤。治療組兩不同壓力下大鼠腎臟組織病理改變減輕，腎小管上皮細胞水腫變性明顯改善，腎小管管型減少，炎性細胞滲出較模型組減輕（圖3B）。

模型3 kg組大鼠肺泡間隔出現輕微斷裂，間質輕度增厚并伴有炎性細胞浸潤；模型5 kg組大鼠肺泡間隔斷裂更加嚴重，間質增厚明顯，可看到間質血管旁及支氣管周圍局灶性炎性細胞浸潤，少量漏入肺泡腔，同時漏入肺泡腔的還有蛋白碎片，可看到透明膜形成。治療組肺組織病理變化可明顯改善，肺泡間質增厚和炎性細胞浸潤得到了抑制（圖3C）。

圖3 解壓72 h后大鼠各組織病理切片（HE×200）

3 討 論

自1941年Bywaters等首次正式提出CS的概念以來，人們對其展開了大量研究。其中的模型研究主要分兩種，一是閉合性模型[2,3]，一是開放性模型[4,5]。筆者認為，閉合性模型更能反映真實地震或車禍中CI的形成。此外，多數研究施加到動物肢體的擠壓力并不精確，本實驗所用擠壓平臺能精確設定擠壓重量及時間，避免了許多不確定性因素。2010年Stratos等[6]通過開放性CI模型研究了不同程度損傷后肌肉組織的恢復情況，但擠壓力與CI損傷程度之間關系仍不明確。本實驗建立的是不同壓力擠壓的閉合性大鼠CI模型，評估其損傷程度，而后給予通過常規補液治療[7]，評估補液治療對不同擠壓力所致CI的療效。

參考大型地震數據平均解救時間選擇16 h為本研究擠壓傷模型擠壓時間[8,9]。研究證實低血容量性休克和高鉀血癥是擠壓綜合征致死的主要原因[1,10]。在本研究中，模型組兩不同壓力組大鼠解壓后72 h生存率和肌肉水腫情況無差異，提示低血容量性休克是解壓后致死的主要原因。盡管補液后5 kg組血鉀較模型組降低，但仍高于正常水平，因此筆者推測在糾正低血容量性休克后，高鉀血癥在影響5 kg壓力組生存率方面發揮了一定的作用。由此可以得出， 較輕的壓力組大鼠死亡的原因是低血容量休克，單純補液治療即可糾正這個主要矛盾，而高壓力組大鼠死亡原因有低血容量性休克和高鉀血癥。

雙下肢擠壓后大鼠血液中各生化指標有明顯升高，模型5 kg組升高更加明顯，說明較高的擠壓力使系統損傷加重。補液治療使5 kg壓力組K+明顯降低，血CK、BUN、Cr也有所降低，但差異不顯著；3 kg壓力組以上各指標模型組與治療組無顯著差異，且5 kg壓力組與3 kg壓力組補液前存在差異，補液后無差異，說明單純補液治療對5 kg壓力組也存在一定的治療效果。3 kg壓力組血生化指標于補液后有升高的趨勢，是否需要采取更加保守的液體復蘇治療，減少液體輸入量，需要進一步研究探討。反映肝損傷的指標ALT、AST解壓后有明顯升高，組間差異不明顯，補液治療后亦未改善，可能由于肝臟對進入血液循環的毒性物質較敏感，低濃度的肌肉分解毒性物質即可引起肝臟強烈反應。

模型組5 kg的擠壓力量使肌纖維嚴重破壞，橫紋肌大片溶解，這是其損傷更加嚴重的基礎。此外，模型5 kg組肌肉組織可觀察到大量炎性細胞滲出，遠隔器官肺組織可看到局灶性炎性細胞浸潤，由此得出5 kg壓力組全身炎性細胞反應較3 kg壓力組嚴重。常規補液治療后肌肉灌注量增加，使肌纖維斷裂、橫紋肌溶解及炎細胞浸潤均減輕。5 kg組和3 kg組于治療后腎小管管型均減少，5 kg組腎間質充血加重，說明補液后腎灌注量增加，沖刷腎小管，使管型減少，腎損傷減輕。模型5 kg組出現廣泛肺間質增厚，補液治療后改善。

綜上所述，本實驗初步證明CI嚴重程度與擠壓力在一定范圍內呈正相關。當壓力進一步增大時，損傷程度是否會進一步加重有待下一步的研究探討。當擠壓力較輕不足以導致嚴重損傷時，單純的補液治療即可明顯改善生存狀況，而較重的擠壓力所致嚴重擠壓傷還應結合實際情況積極進行聯合治療。

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（2017-01-06收稿2017-03-13修回）

（本文編輯 羅發菊）

Correlation between the severity of crush injury in rats and the different crushing force

WANG Xin1，2, LYV Qi2, DING Hui2, LIU Ziquan2, ZENG Xihuan2, WANG Jing2, and HOU Shike2. 1. Specialty of Emergency Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China; 2. Institute of Disaster Medicine and Public Health, Affiliated Hospital of Logistic University of Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300162, China
Corresponding author: HOU Shike, Email: houshike@126.com

ObjectiveThis study aimed to identify the correlation between the severity of crush injury and the different crushing force.MethodsA total sample of 127 male Wistar rats were randomly divided into a control group (n=15), crush injury group (n=56) and treatment group (n=56). Rats in crush injury and treatment groups suffered bilateral hind limbs crushed with 3 kg and 5 kg forces for 16 hrs, the treatment group received 1 ml/(kg·h) conventional rehydration treatment for 6 hrs following the release of the compressive force. Blood and muscle tissue samples were collected at 24 hrs and 72 hrs after the release of the compressive force for testing of biochemical parameters and the wet dry ratio; tissue samples of each group for histopathologic evaluation was collected at 72 hrs after release of the compressive force; the 72 hr survival rate of each group was recorded.ResultsBiochemical indicators [potassium ions (K+), creatine kinase (CK), blood urea nitrogen (BUN), creatinine (Cr), alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST)] in the crush injury group were all significantly increased 24 hrs after release of the compressive force (P＜0.001) as compared to the control group; the levels of serum biochemical indicators in the 5 kg group were significantly higher 24 hrs after the release of the compressive force compared with 3 kg group (P＜0.01). A large part of rhabdomyolysis and a wide range of renal casts could be found in the 5 kg group, and focal inflammatory cell infiltration and interval thickening appeared in its remote organ lung, but there was no difference in muscle swelling and the 72 hr survival rate between the 3 kg and 5 kg force groups; after receiving conventional rehydration treatment, the biochemical indicators of the 3 kg and 5 kg groups showed little change, however pathological damage was less, renal casts were reduced; a wide range of muscle-cell necrosis and the thickening of alveolar septum were not found in 5 kg group, and its inflammatory cell infiltration was also reduced, but the survival rate was not improved. Compared with the crush injury group, the mortality rate was decreased in 3 kg group (P=0.047). After treatment the wet dry ratio increased caused by the increase of perfusion.ConclusionsThe severity of crush injury was positively correlated with the amount of crushing force within certain realms.

crush injury; different crushing force; severity of damage; rehydration treatment

R642

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.04.001

十三五重點研發計劃（2016YFC0802806）；天津市科技計劃課題（15ZXLCSY00040，15PTGCCX00130）

1. 453003，河南省新鄉醫學院急診醫學專業；2. 300162 天津，武警后勤學院附屬醫院救援醫學研究所

侯世科，E-mail：houshike@126.com