抗高原反應中藥紅景天化學成分的潛在靶標研究

梁子亮，張旭毅，歐陽璞心，王 藩，劉海峰，劉惠亮

抗高原反應中藥紅景天化學成分的潛在靶標研究

梁子亮，張旭毅，歐陽璞心，王 藩，劉海峰，劉惠亮

目的紅景天作為抗高原反應的常用中藥，其化學成分的作用靶標和機制一直未得到明確闡釋，本研究從文獻調研的187種紅景天化學成分出發，針對缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)降解途徑的10個靶標，利用AutoDock Vina分子對接程序，對化學成分和靶標之間的相互作用進行研究。方法（1）構建了187種化學成分數據庫；（2）對靶標晶體結構進行復原測試，以均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）進行評價，最終確定靶標蛋白對接參數，成功構建10個靶標信息的靶標數據庫；（3）對化合物數據庫的187個化合物與靶標數據庫的10個靶標及其參數進行兩兩分子對接，得到排名前5%的化合物為陽性化合物，構建化合物-靶標相互作用網絡圖。結果紅景天中的18種化學成分與3個以上的靶標有相互作用，驗證了紅景天多靶點作用的分子機制。結論在所篩選出的化合物中，化合物15（Rhodionin）、16（Rhodiosin）、26（Crenulatin）、56（Pharienside）和184（Pyridrde）是已報道的紅景天的藥理活性成分，本研究分別將其結構及對應作用靶標羅列出來，為紅景天藥理成分的靶標確定及后期研發提供參考。

紅景天；高原反應；靶標；HIF-1α；分子對接

武警官兵高原訓練及災害救援時常發生高原反應，對工作進程及效果造成嚴重影響。紅景天（Rhodiola roseaL.）為我國傳統藏藥用植物，具有與人參、刺五加類似的“適應原樣”作用，具有抗缺氧、抗氧化、抗疲勞和抗腫瘤等功效[1]。研究表明，紅景天調節心肌細胞中的缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達是治療高原缺氧的途徑之一，其促進HIF-1α及其下游血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達可能是其抗缺氧的作用機制，紅景天誘導HIF-1α表達增加主要通過抑制HIF-1α的降解，而不是增加HIF-1α mRNA翻譯[1]。研究表明，紅景天可通過抑制HIF-1α蛋白降解，增加HIF-1α穩定性[2]。

本研究以文獻收集的紅景天化學成分為對象，采用AutoDock Vina軟件的分子對接方法[3]，分析紅景天化學成分與HIF-1α降解途徑靶標的關系，試圖從HIF-1α降解途徑切入，了解紅景天的潛在作用靶標，為紅景天治療急性高原反應的機制提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 天津中醫藥大學周江韜等[4]對紅景天近二十年分離鑒定的化學成分進行總結，得到187種化合物。

1.2數據庫構建 針對這187種化合物構建紅景天化學成分數據庫，首先采用ChemBioOffice中的ChemDraw軟件畫結構，保存為cdx文件（二維結構）；然后將化合物導入Chem3D轉換為三維格式并用MM2力場進行能量優化，優化完成后保存為mol2格式文件；最后用AutoDock Tools進行蛋白準備，包括加H、加電荷和格式轉換，保存為pdbqt文件。值得注意的是，化合物184的結構與其他文獻[5，6]有所出入，經過調研，最終確定184的結構，且最終構建得到的紅景天化學成分數據庫為pdbqt格式，化合物結構和編號均與文獻[4]保持一致，見表1。

表1 化合物184結構

1.3HIF-1α降解途徑靶標的準備

1.3.1靶標的確定 本研究以HIF-1α降解途徑相關靶標為研究對象。HIF-1α的降解途徑有腫瘤抑制蛋白（von Hippel-Lindau protein, pVHL）依賴途徑和非pVHL依賴途徑兩類。（1）pVHL依賴途徑。在常氧狀態時，HIF-1α的PRO402和PRO564位點能夠被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD）識別并羥基化，被羥基化的HIF-1α與pVHL結合，而pVHL能夠富集elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素連接酶，最終經過26S蛋白酶體介導降解[7,8]。在此O2/ pVHL/PHD途徑中，有研究表明，乙酰轉移酶（arrest-defective-1，ARD1）乙酰化HIF-1α的LYS532，將增強其與pVHL蛋白復合體的結合[9]；骨肉瘤-9（osteosarcoma-9，OS-9）能夠通過與HIF-1α/PHD2或HIF-1α/PHD3復合物結合而促進降解[10]；（spermidine/spermine-N1-acetyltransferase-2，SSAT2）與pVHL/E3連接酶結合[11]；最終均能促進HIF-1α的降解。（2）pVHL非依賴途徑。除了pVHL途徑，受體激活C-激酶1（receptor for activated C-kinase1，RACK1）也可富集elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素連接酶誘導其泛素化降解[12]；人精脒/精胺N1-乙酰基轉移酶1（spermidine/spermine-N1-acetyltransferase-1， SSAT1）則能穩定RACK1和HIF-1α的相互作用[13]；糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）通過對HIF-1α的磷酸化修飾促進非pVHL途徑HIF-1α降解[14]。此外，E3連接酶（human double minute 2，Hdm2）[15]，叉頭狀轉錄因子O4（forkhead transcription factor O4，FOXO4）均被報道有促進HIF-1α降解作用。

因此，筆者所在團隊選擇能夠促進HIF-1α降解途徑的pVHL、PHD、ARD1、OS-9、SSAT2、RACK1、SSAT1、GSK3β、Hdm2和FOXO4等10個靶標為目標靶標。如果紅景天與其中的靶標結合并抑制其活性，HIF-1α的降解途徑將會被抑制，穩定性得到增加。

1.3.2靶標晶體結構和活性位點的確定 確定上述10個目標靶標后，進一步確定靶標的三維晶體結構用于計算模擬。首先，通過NCBI數據庫對上述靶標名稱分別進行檢索，得到該靶標的基因和序列信息；然后，用靶標序列與PDB數據庫進行序列比對，以一致性（identity）和覆蓋率（coverage）作為判斷標準，一致性大于30%、覆蓋靶標功能域的晶體結構作為候選靶標晶體結構蛋白；若一個靶標通過序列比對得到多個晶體結構蛋白，則解析度高、序列長度完整、包含配體分子的蛋白結構優先考慮。

晶體結構活性位點以原配體所在位置為準，對于無配體的RACK1靶標，通過文獻調研確定其活性位點。研究表明，RACK1通過7個WD重復結構域與細胞內特殊蛋白質相互作用[13]，其與HIF-1α是通過二聚體中的WD6結構域進行結合[14]。因此，筆者所在團隊劃定RACK1晶體結構4AOW的WD6位置為活性位點（圖1）。

圖1 RACK1（PDB編號4AOW）晶體結構

1.4分子對接條件測試 在分子對接前，需對分子對接方法和參數進行測試驗證，以確定其適用于該體系的計算模擬工作。常用的復原測試方法為將靶標蛋白晶體結構配體對接到該靶標蛋白上，如能重現晶體結構配體構象（RMSD≤2.0 A），則復原成功，可用于下一步的靶標蛋白-化合物分子對接工作。

無配體分子的靶標RACK1和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）結合的FOXO4排除在外，其他8個靶標蛋白均做復原測試，來調整和確定分子對接參數。分子對接采用AutoDock Vina軟件，需要準備好蛋白文件、配體文件和活性位點參數文件。蛋白質準備首先用Pymol軟件去除水、溶劑和配體分子，然后用AutoDock Tools加H、加電荷；配體分子準備包括用Pymol軟件導入晶體結構中配體，以及用AutoDock Tools軟件對其加H、加電荷等操作；活性位點參數文件（X_center，Y_center，Z_center；X_size， Y_ size， Z_size）限定對接盒子的中心和大小，不同靶標體系的盒子設置不盡相同。最后，復原結果好壞用對接后構象與配體構象的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）來評價。

由表2可見，靶標ARD1、GSK3β、Hdm2、PHD2、pVHL和SSAT2對接后構象與晶體結構配體構象的RMSD值均≤2.0 A，復原成功；而靶標OS-9和SSAT1的復原RMSD＞2.0 A，復原失敗。

表2 復原參數和結果

由圖2A-C可見，靶標OS-9復原結果，MAN301、MAN302兩個糖環能夠較好地復原，而BMA300相差較大（圖2A）。分析晶體結構發現，BMA300-MAN301-MAN302組成的多糖結合在蛋白表面，與完全包埋在蛋白口袋內的配體相比，蛋白口袋信息較少，模擬難度較大；結合模式上，對接后構象（圖2C）保留了原配體構象（圖2B）與蛋白殘基TRP118、GLN130、GLU212和TYR218的主要氫鍵相互作用，而以較弱的范德華力結合（圖2B）的BMA300未能復原成功，對接后構象的BMA300基團更偏向于與TYR120、GLU212以更強的氫鍵作用結合。

SSAT1的復原結果（圖2）顯示，其包埋在蛋白口袋內的脂肪鏈可以較好地重合（圖2D），主要的氫鍵相互作用也能很好地復原（圖2E，2F），蛋白口袋外的嘌呤環復原失敗，與OS-9類似，均由于該基團周圍的蛋白環境信息太少，導致計算模擬較難復原。

因此，OS-9和SSAT1的配體中主要基團（蛋白口袋內）能夠較好地復原重合，蛋白活性口袋外的基團復原失敗，均為體系原因所致，對接參數和方法仍可以接受，用于后續的分子對接工作。

圖2 靶標OS9和SSAT1復原結果

1.4靶標數據庫的構建 將分子對接條件測試后準備好的蛋白質文件（pdbqt格式）和活性位點參數文件（txt文件）保存，構成pVHL、PHD、ARD1、OS-9、SSAT2、RACK1、SSAT1、GSK3B、Hdm2和FOXO4 10個靶標的靶標數據庫。

1.5紅景天化學成分與靶標的分子對接 將靶標數據庫中的10個靶標文件與化合物數據庫中的187個化合物兩兩分子對接，對接軟件為AutoDock Vina，活性位點參數為靶標數據庫中的文本文件，分子對接參數設置生成構象數（num_modes）為20，其他參數默認。

2 結 果

2.1靶標與化合物相互作用 每個靶標和187個化合物的得分按照親和力排序，將前5%（Top9）的化合物作為陽性結果，認為其與對應靶標能夠結合，若Top9有多個相同得分的化合物，所有相同得分的化合物均保留，10個靶標的前5%化合物個數為9到13個不等（表3）。另外，分子對接得分與靶標體系相關，化合物-靶標的相互作用需針對某個特定靶標相對來看，靶標間的數值無可比性。

表3 排名前5%結果信息列表

將上述靶標-化合物相互作用信息導入Cytoscape軟件構建網絡圖，可以看到（圖3），與化合物45、29、169、16相互作用的靶標個數分別是8、6、6、5；化合物5、17、31、181和187與其中4個靶標有相互作用；化合物3、4、6、9、15、26、27、168和182與其中3個靶標有相互作用。由此可知，紅景天能夠很好地發揮中藥多成分多靶點的優勢，其可能通過氧依賴的pVHL途徑來抑制HIF-1α降解，提高HIF-1α穩定性，激活下游的多個靶標基因，也可能是通過RACK1途徑達到這一目的。

2.2已知活性成分與多靶標化合物 在與HIF-1α降解靶標相互作用的化合物中，化合物15（Rhodionin）[14]、16（Rhodiosin）[5]、26（Crenulatin）[13]、56（Pharienside）[14]和184（Pyridrde）是已報道的紅景天的活性成分。

2.3化合物56與靶標SSAT1結合模式 以化合物56為例，分析其與靶標SSAT1的結合模式，作為化合物-靶標相互作用的參考。從結合模式圖（圖4A）可以看到，化合物56苯環和糖環上的羥基與殘基GLU28、GLU92、ASP93、PHE94、GLY102、PHE103、GLY104、ILE105、SER107、LEU128和ARG143形成氫鍵相互作用，連接段的苯環與PHE94、PHE139和TYR140的芳香口袋形成芳香堆砌作用，脂基與SER136和TYR140形成氫鍵作用；靜電勢圖（圖4B）可以看到，化合物56能夠較好地與SSAT1的口袋契合，苯環與疏水口袋形成疏水和范德華作用力，糖環與正電性口袋形成靜電互補。

圖3 化合物-靶標相互作用網絡圖

圖4 化合物56與靶標SSAT1的結合模式

3 討 論

武警官兵高原訓練常發生高原反應，尤其是剛進入高原的新兵，高原反應較為嚴重，不僅增加了官兵的心理負擔，還對整個訓練進程和效果造成影響。紅景天是抗高原反應的有效中藥，考察其活性成分的可能作用靶標有助于了解其抗高原反應的作用機制和應用，但過分依賴于單味成分并不能完全反映紅景天中藥復方的實際組成和效應。HIF-1是一種與缺氧有關的重要轉錄調節因子，為α亞基和β亞基組成的異二聚體，常氧狀態下，HIF-1α蛋白經泛素蛋白酶系統快速降解[14]，低氧狀態下，HIF-1α的蛋白降解受到抑制，與HIF-1β亞基形成具有轉錄活性的異二聚體HIF-1，并與靶基因啟動子區域的缺氧反應元件(hypoxia response element，HRE)結合來激活包括VEGF、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）等在內的近60個靶基因的轉錄功能，引發一系列生理效應[2,14,15]。

本項目針對HIF-1α的降解途徑研究紅景天化學成分的潛在作用靶標，分析10個降解途徑相關靶標和化合物的相互作用，但這并不是紅景天作用的唯一途徑，除了直接作用HIF-1α降解途徑相關靶標，其還可能通過通路間接調控HIF-1α降解靶標[14]；除降解途徑外，紅景天也可能通過其他途徑，比如HIF-1α合成途徑來增加HIF-1α的穩定性[12]，激活其下游靶標基因。

本研究建立了紅景天187種化學成分的化合物數據庫（pdbqt文件），構建了HIF-1α降解途徑的10個靶標數據（蛋白pdbqt文件和活性位點參數文件），用分子模擬的方法預測化學成分與靶標的相互作用，結果發現，紅景天的多種化學成分能夠同時作用于HIF-1α降解途徑相關的多個靶標，

此外，已報道的藥理活性成分15（Rhodionin）、16（Rhodiosin）、26（Crenulatin）、56（Pharienside）和184（Pyridrde）的潛在作用靶標的相互作用也被預測出來，為紅景天化學成分作用靶標及機制研究提供參考。

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（2016-12-20收稿2017-01-12修回）

（本文編輯 孫秀明）

Potential target of chemical constituents from the Rhodiola plants

LIANG Ziliang, ZHANG Xuyi, OUYANG Puxin， WANG Fan, LIU Haifeng, and LIU Huiliang. Department of Medical Office, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China
Corresponding author: LIU Huiliang, E-mail: lhl518@vip.sina.com

ObjectiveRhodiolais a commonly used drug for resistance to altitude sickness, however the target of its chemical constituents and mechanism of action have not been clearly explained. In this paper, 187 chemical constituents ofRhodiolawere collected through a literature review, AutoDock Vina, a molecular docking program, was used to predict the interaction between chemical constituents and 10 identifiable targets of (hypoxia-inducible factor 1α) HIF-1α degradation pathway.Methods(1) A database comprising of the 187Rhodiolachemical components was built; (2) A recovery test was performed on 10 target proteins with root-mean-square deviation (RMSD) as the evaluation criterion, the docking parameter was identified and target database was built; (3) Molecular docking between 187 chemical components and 10 targets, and as well as their parameters were run through the databases. The top 5% chemical components were regarded as positive to establish the compound-target interaction network graph.Results18 compounds inRhodiolainteracted with more than 3 targets, which proved the muti-target molecular mechanism ofRhodiola.ConclusionsSome active constituents previously reported had been screened out, such as Rhodionin, Rhodiosin, Crenulatin, Pharienside and Pyridrde. The structure and target information was listed to provide reference for the determination of targets and future research and development on pharmaceutical components ofRhodiola.

Rhodiola; altitude sickness; target; HIF-1α; molecular docking

O64

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.04.002

首都醫學發展專項( 2014-2-5131)；武警總醫院院級課題（WZ2015008）

100039 北京，武警總醫院醫療科

劉惠亮，E-mail：lhl518@vip.sina.com