纈沙坦對心力衰竭家兔心肌細胞肌漿網蘭尼堿受體的影響

曲輔政，張曉錄，孫經武，劉現亮，王東，史孟松，王秀花，曲愛燕，路新磊，周紅霞，程林，康浩飛，衣曉蕊，劉靜

基礎與實驗研究

纈沙坦對心力衰竭家兔心肌細胞肌漿網蘭尼堿受體的影響

曲輔政，張曉錄，孫經武，劉現亮，王東，史孟松，王秀花，曲愛燕，路新磊，周紅霞，程林，康浩飛，衣曉蕊，劉靜

目的：探討家兔慢性心力衰竭(心衰)時心肌細胞肌漿網蘭尼堿受體（RyR2）表達及其釋鈣功能的改變以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦長期干預的意義。

方法：27只家兔隨機分為三組：假手術組（n=9）、心衰組（n=9）和纈沙坦組（n=9），通過超容量負荷聯合壓力負荷建立家兔心衰模型，于術后7周觀察左心室結構、血流動力學的變化及心肌細胞肌漿網RyR2的表達和功能的改變。

結果：與假手術組比較，心衰組左心室重量指數、左心室舒張末壓顯著升高（P＜0.05），左心室短軸縮短率及左心室射血分數明顯降低（P＜0.05）；與心衰組比較，纈沙坦組左心室重量指數、左心室舒張末期壓力顯著降低（P＜0.05），左心室短軸縮短率及左心室射血分數明顯升高（P＜0.05）；心衰組心肌細胞肌漿網RyR2表達和其釋鈣功能顯著低于假手術組（P＜0.05）；纈沙坦組心肌細胞肌漿網RyR2表達和其釋鈣功能顯著高于心衰組（P＜0.05）。

結論：長期應用纈沙坦能夠改善心臟舒縮功能，可能與其增加心肌細胞肌漿網RyR2表達和其釋鈣功能有關。

心力衰竭；肌漿網；蘭尼堿受體鈣釋放通道

心力衰竭（心衰）是臨床常見的危重癥之一，死亡率高，嚴重威脅患者的生命。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）可選擇性作用于心臟AT1受體，逆轉心室和血管壁的重構，促進心臟功能的恢復[1]。研究表明，心肌細胞肌漿網蘭尼堿受體（ryanodine receptor2，RyR2）的異常在心衰的發病機制中發揮重要作用[2]。目前國內鮮有關于心衰時心肌細胞肌漿網RyR2的變化以及纈沙坦進行長期干預對心功能影響的報道。本實驗通過用超容量負荷聯合壓力負荷建立家兔心衰模型，進而觀察纈沙坦對心肌細胞肌漿網RyR2表達和功能的影響，從而探討纈沙坦改善心功能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和材料

家兔27只，雌雄不限，體重2.0～2.2 kg，由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供。SCHILLER TM-7型有創血壓監護儀產自瑞士，Taq DNA聚合酶及逆轉錄試劑盒為立陶宛Fermentas公司產品，聚合酶鏈式反應（PCR）引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成，低溫離心機產自德國，PCR儀（Touchgene Gradient）產自英國，Bio Rad電泳轉印儀產自美國，KPL 蛋白免疫印跡法（western blot）試劑盒產自美國，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海西唐生物公司，RyR2一抗購于美國ABR公司，β-肌動蛋白（β-actin）一抗購于美國Upstate公司, 二抗羊抗兔IgG購于上海西唐生物公司， Fura-2·pentapotassium salt購于瑞士Alexis公司，胡蘿卜內酯和乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）購于德國Sigma公司，LAMBDADG-4 Ca2+濃度熒光測定儀購于美國，IX71倒置顯微鏡購于日本。

1.2心衰模型的建立

家兔經心臟超聲檢查，排除器質性病變后，隨機分為假手術組（n=9）、心衰組（n=9）、纈沙坦組（n=9）。心衰組、纈沙坦組家兔利用超容量負荷聯合壓力負荷建立心衰模型[3,4]，纈沙坦組家兔在主動脈關閉不全后第2天開始給予纈沙坦20 mg/（kg·d）。術后7周心臟超聲測定左心室短軸縮短率（LVFS）及左心室射血分數（LVEF），左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）利用心導管術測定左心室收縮末期壓力（LVESP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）；然后處死家兔，取出心臟，剪下左心室心肌組織稱重，獲得左心室重量（LVW），計算左心室重量指數（LVMI），心肌組織于-70℃保存備用。

1.3半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）

根據Genebank的序列，并參考相關文獻，分別設計RyR2及內參照β-actin的引物序列。RyR2正義引物：F-AACACATGCCCAACGACAC，反義引物：AAGTAAACCCTCTCGATGCGT；β-actin正義引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT，反義引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG 。 用Trizol提取心肌的總RNA，逆轉錄成ucDNA，-20℃保存。PCR反應體積為50 μl，含RT產物2 μl，10×buffer 5 μl,上下游引物各0.5 μmol/L，dNTP200 μmol/L，MgCl21.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U。反應程序為93℃ 預變性3 min，然后進入PCR循環，93℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次再延伸7 min。RyR2與β-actin擴增片段長度分別為130、231 bp。RT-PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio Rad凝膠成像系統quantity one軟件分析條帶灰度，計算RyR2與β-actin擴增條帶灰度比。

1.4蛋白表達的測定

蛋白提取：取左心室肌組織標本100 mg，剪碎，置于離心管中，加入細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，用高速勻漿器打碎，4℃離心800 g，5 min；取上清液置于超速離心管中，4℃離心12 000 g，1 h；棄上清，沉淀物為膜蛋白，用BCA法測定蛋白濃度[5]，-70℃保存。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：取含20 μg總蛋白的樣本，于100℃煮沸5 min，用非連續梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白（RyR2分子量為565 kD，分離膠濃度為6%，濃縮膠濃度為3%）；首先電壓100 V、15 min直到樣品在濃縮膠底部成一直線，然后電壓200 V、180 min至溴酚藍到達分離膠底部。

Western blot：在冰水中將凝膠上的蛋白電轉移到硝酸纖維膜上，電壓110 V、75 min；然后硝酸纖維膜置于封閉液中，室溫溫育1 h；再加入一抗（RyR2抗體滴度為1：500、β-actin抗體滴度為1：1000）封閉，4℃冰箱過夜。次日用洗液漂洗；再加入1：10000二抗（二抗為羊抗兔IgG），溫育1 h；然后用洗液漂洗。最后將顯色劑LumiGLO A液和B液1:1混合，直接加到硝酸纖維膜上；1 min后將顯色液用吸水紙吸干，放入暗盒，加蓋一層透明薄膜，曝光2 min。

蛋白表達半定量分析：將膠片掃描至計算機內，應用UVIDoc成像儀進行蛋白條帶灰度分析；RyR2與β-actin灰度比值表示蛋白表達半定量水平。

1.5心肌細胞肌漿網提取步驟：

參照改良的Jones等[6]的方法制備肌漿網。（1）取液氮中黃豆至花生米大小的心肌組織，剪碎后置入離心管中，加入5倍體積的緩沖液A[30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），2 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），3 mmol/L MgCl2，0.1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH=7.2]，用勻漿器將它們勻漿，然后用2層和4層紗布分別過濾1次；（2）4℃，3 800 g離心20 min；（3）取上清液，移入新離心管中，4℃，14 000 g離心20 min；（4）取上清液，移入新離心管中，4℃，45 000g離心60 min；（5）棄上清液，收集沉淀，用緩沖液B（30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L蔗糖，0.1mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，0.5 mol/L KCl，pH=7.0）1 ml懸浮，用勻漿器打勻，4℃，45 000 g離心60 min；（6）收集沉淀，用緩沖液C（30 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，pH=7.0）1 ml懸浮，用勻漿器充分混勻以形成肌漿網囊泡，蛋白含量的測定采用BCA法。

1.6RyR2釋鈣功能的測定[7]

（1）取反應液（Tris-HCl 20 mmol/L，KCl 100 mmol/L，MgCl25 mmol/L，NaN35 mmol/L，草酸鉀 5 mmol/L，CaCl20.1mmol/L，pH=6.8）2 ml與肌漿網囊泡蛋白15 μg/ml、Fura-2 2 μm/L，室溫下避光在玻璃培養皿放置5 min；（2）把玻璃培養皿放在倒置顯微鏡下，打開LAMBDADG-4 Ca2+濃度熒光測定儀，激發波長設為340 nm和380 nm，發射波長設為510 nm，然后分別以340 nm和380 nm的波長激發，510 nm發射，在避光條件下記錄熒光強度的變化以及R值（340 nm熒光強度/380 nm熒光強度比值）的變化；（3） 熒光強度平穩后加入ATP-2Na 4 μm/ml觸發反應，測定R比值；（4）再加入1 μm/L肌漿網鈣泵抑制劑毒胡蘿卜內酯（thapsigargin）和1 mmol/L EGTA誘導鈣釋放，15 s后再測定R值；（5）RyR2釋鈣能力的計算：[Ca2+]=Kd×（Rt-Rmin）/（Rmax-Rt） ×Sf2/Sb2（Kd為Fura-2對Ca2+的離解常數，Rt為Fura-2在t時間的熒光強度比值，Rmin為Fura-2在沒有Ca2+的游離時的熒光強度比值，Rmax為Fura-2在飽和Ca2+的熒光強度比值，Sf2/Sb2為380 nm處游離時Fura-2與飽和Fura-2熒光強度比值）。

1.7統計學分析

2 結果

2.1三組家兔血流動力學和心功能比較（表1）

家兔飼養過程中，心衰組有3只不明原因死亡，纈沙坦組有2只死亡，發生在3周左右；假手術組無死亡，各組取6只作比較。心衰組解剖時可見皮下、胸腔、腹腔大量積水，而假手術組、纈沙坦組無以上表現；術前3組家兔手術前血流動力學和心功能比較無明顯差別。術后7周，與假手術組相比，心衰組LVW、LVMI、心率、LVEDD、LVESD、LVEDP、LVESP顯著升高，LVFS及LVEF明顯降低；纈沙坦組的LVW、LVMI、心率、LVEDP、LVESP、LVEDD、LVESD顯著低于心衰組，LVFS及LVEF明顯高于心衰組。

表1 三組家兔術前、術后7周血流動力學和心功能指標比較

表1 三組家兔術前、術后7周血流動力學和心功能指標比較

注：LVW：左心室重量；LVMI：左心室重量指數；LVEDD：左心室舒張末期內徑；LVESD：左心室收縮末期內徑；LVEDP：左心室舒張末期壓力；LVESP：左心室收縮末期壓力；LVFS：左心室短軸縮短率；LVEF：左心室射血分數。與假手術組比*P＜0.05；與心衰組比△P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

指標 假手術組 (n=6) 心衰組 (n=6) 纈沙坦組 (n=6)術前LVW (g) 2.43±0.12 2.45±0.15 2.40±0.14 LVMI (g/kg) 1.30±0.07 1.33±0.05 1.35±0.02心率 (次/min) 244.80±10.90 242.00±5.40 247.67±3.78 LVEDD (mm) 14.52±1.42 15.80±2.47 15.70±1.04 LVESD (mm) 8.56±0.78 10.10±1.96 8.98±0.86 LVEDP (mmHg) -1.00±0.89 -1.17±0.75 -0.50±1.05 LVESP (mmHg) 113.17±4.75 111.17±2.64 112.83±4.17 LVFS (%) 41.35±3.75 37.50±3.41 41.86±2.67 LVEF (%) 74.22±2.97 76.57±2.82 74.70±2.36術后7周LVW (g) 2.48±0.15 7.15±0.59* 4.82±0.21△LVMI (g/kg) 1.32±0.06 3.61±0.09* 2.07±0.14△心率 (次/min) 244.67±9.39 270.50±2.88* 252.67±3.50△LVEDD (mm) 13.33±1.79 21.40±2.53* 17.58±1.96△LVESD (mm) 8.3±11.43 17.17±2.14* 11.53±0.99△LVEDP (mmHg) -0.50±1.05 23.00±2.37* 2.17±0.72△LVESP (mmHg) 112.67±3.78 139.50±3.08* 122.17±0.75△LVFS (%) 37.83±3.58 17.38±3.13* 33.83±2.85△LVEF (%) 71.92±4.56 38.50±6.07* 64.45±3.66△

2.2三組家兔心肌細胞肌漿網RyR2 mRNA水平比較（圖1）

與假手術組相比，心衰組的RyR2 mRNA水平顯著下降（灰度比：0.86±0.12 vs 0.70±0.06，P＜0.05），而纈沙坦組的RyR2 mRNA水平明顯高于心衰組（灰度比：0.70±0.06 vs 0.50±0.03，P＜0.05），差異均有統計學意義。

圖1 逆轉錄聚合酶鏈式反應分析家兔手術7周后心肌細胞肌漿網RyR2 mRNA表達的電泳圖

2.3三組家兔心肌細胞肌漿網RyR2蛋白的比較（圖2）

心衰組心肌RyR2蛋白表達顯著低于假手術組（灰度比：0.73±0.03 vs 0.90±0.02，P＜0.05），纈沙坦組顯著高于心衰組（灰度比：0.90±0.02 vs0.46±0.01，P＜0.05），差異均有統計學意義。

圖2 3組家兔心肌細胞肌漿網RyR2蛋白印跡結果

2.4三組家兔心肌細胞肌漿網RyR2釋鈣功能的比較

用肌漿網外液加入胡蘿卜內酯和EGTA后Ca2+濃度升高的百分比表示心肌細胞肌漿網RyR2攝鈣能力，心衰組肌漿網RyR2釋鈣功能明顯低于假手術組 [（20.16±1.28）% vs （45.32±1.92）%， P＜0.05]，纈沙坦組肌漿網RyR2釋鈣功能顯著高于心衰組[（33.51±2.13）% vs（20.16±1.28）%， P＜0.05]。

3 討論

RyR是一種鈣離子釋放通道，根據不同的組織分布，RyR分為三類: RyR1、RyR2和RyR3，在心肌細胞中分布的主要是RyR2。大量證據表明，鈣循環異常在心衰的發展中起著重要作用[8]。鈣循環主要包括肌漿網鈣釋放、鈣回攝及鈣儲存三個過程。鈣釋放是由肌漿網RyR2完成。心肌細胞膜除極化，引起電壓依賴性L型通道開放，少量鈣離子內流入細胞質，成為肌漿網鈣離子釋放觸發器。cAMP依賴的蛋白激酶A（PKA）或鈣/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）對RyR2磷酸化，激活RyR2通道，使與其緊密結合的通道穩定蛋白（Calstabin2，FKBP12.6，FK506結合蛋白）解離，肌漿網內的鈣離子大量釋放，鈣離子與肌鈣蛋白結合，引起心肌收縮。大多研究顯示心衰時RyR2的表達和活性是降低的[9]。RyR2表達及活性降低將直接導致肌漿網釋放鈣減少，心肌收縮下降，進而導致心衰。

本研究顯示，7周后心衰組家兔均表現為不同程度的進食和活動減少，呼吸頻率增快；LVW、LVMI、LVEDP明顯增加；LVFS及LVEF明顯降低；解剖時可見皮下、胸腔、腹腔大量積水。以上結果表明，心衰組家兔在超容量負荷及壓力負荷的影響下，結構上表現為心室重構，功能上表現為收縮功能降低，最終發展為左心衰竭。與假手術組相比，心衰組RyR2的表達和活性顯著降低，肌漿網的釋鈣能力下降，與以往的報道一致[10]。

國外研究表明血管緊張素Ⅱ可以引起心衰心肌的RyR2表達和功能降低[11-13]。國內姚艷等[14]研究氯沙坦長期干預心衰，能夠改善心臟舒縮功能,可能與其上調肌漿網的鈣調控蛋白 SERCA2、RyR2、PLB 的基因表達有關。

本實驗研究表明纈沙坦長期干預心衰，可明顯增加RyR2的表達和活性，提高肌漿網的釋鈣能力，顯著改善血流動力學，緩解心室肥厚。纈沙坦作為一種ARB類藥物，主要通過與AT1受體結合，競爭性抑制血管緊張素Ⅱ的生物學效應而發揮作用。具體機制可能包括以下因素：（1）纈沙坦作為血管擴張劑降低了心臟的前后負荷，降低了室壁的張力，改善了促使心室重構的血流動力異常；（2）抑制了心肌細胞凋亡、肥大和膠原的增生；（3）抑制了交感神經的過度激活；（4）增強了血管緊張素Ⅱ受體的良性心血管效應；（5）抑制了炎癥因子等；（6）抑制RAS系統，增加了RyR2的表達和功能；（7）抑制了心衰時肌漿網鈣調控相關蛋白的改變，恢復鈣介導的興奮-收縮耦聯等[15,16]。

總之，本實驗研究結果表明，心衰家兔RyR2的表達和活性降低，肌漿網的釋鈣能力下降，從而影響心肌舒縮功能，這將為心衰治療提供新的方向。纈沙坦長期干預心衰，改善心臟舒縮功能，可能與其增加RyR2的表達和活性，提高肌漿網的釋鈣能力有關。

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Impact of Valsartan on Sarcoplasmic Reticulum Ryanodine Receptor2 in Myocardiocyte of Heart Failure Rabbits

QU Fu-zheng, ZHANG Xiao-lu, SUN Jing-wu, LIU Xian-liang, WANG Dong, SHI Meng-song, WANG Xiu-hua, QU Ai-yan, LU Xin-lei, ZHOU Hong-xia, CHENG Lin, KANG Hao-fei, YI Xiao-rui, LIU Jing.
Department of Cardiology, Yantai Affiliated Hospital of Bin Zhou Medical College, Yantai (264100), Shandong, China Corresponding Author: SUN Jing-wu, Email: bysjw@163.com

Objective: To explore sarcoplasmic reticulum ryanodine receptor2 (RyR 2) expression and calcium releasing function in chronic heart failure (CHF) rabbits and to study the impact of long term valsartan treatment in relevant animals.

Methods: HF model was established by volume overloading with pressure overloading in experimental rabbits. 27 rabbits were divided into 3 groups: Sham group, HF group and HF+valsartan group. n=9 in each group and the animals were treated for 7 weeks. Left ventricular structure, hemodynamic parameters, expression and functional changes of myocardiocyte sarcoplasmic reticulum RyR 2 were observed and compared among different groups.

Results: Compared with Sham group, HF group had increased left ventricular mess index (LVMI), left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) and decreased left ventricular shortening fraction, LVEF, all P＜0.05. Compared with HF group, HF+valsartan group showed decreased LVMI, LVEDP and increased left ventricular shortening fraction, LVEF, all P＜0.05. Sarcoplasmic reticulum RyR 2 expression and calcium releasing function were lower in HF group than Sham group, P＜0.05; while they were both higher in HF+valsartan group than HF group, P＜0.05.

Conclusion: Long term application of valsartan could improve the cardiac function which might be related to increased myocardial sarcoplasmic reticulum RyR 2 expression and calcium releasing function in experimental CHF rabbits.

Heart failure; Sarcoplasmic reticulum; Ryanodine receptor calcium release channel

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:390.)

2016-05-10）

（編輯：許菁）

264100 山東省煙臺市，濱州醫學院煙臺附屬醫院 心內科（曲輔政、孫經武、劉現亮、王東、史孟松、王秀花、曲愛燕、路新磊、周紅霞、程林、康浩飛、衣曉蕊、劉靜）；煙臺毓璜頂醫院 檢驗科（張曉錄）

曲輔政 副主任醫師 博士 主要從事心力衰竭的發病機制研究 Email: qufuzheng2005@126.com 通訊作者：孫經武 Email: bysjw@163.com

R54

A

1000-3614（2017）04-0390-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.04.019