HPLC-MS/MS測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留試驗研究

高均超

摘 要：因硝基呋喃類代謝物具有高毒性和致癌性，引起了相關(guān)部門和人員的高度重視。經(jīng)過試驗，簡要研究了水產(chǎn)品中4種硝基呋喃代謝物——呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）測定分析方法。試驗結(jié)果表明，這種方法靈敏、準(zhǔn)確、高效，能夠滿足檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的要求。

關(guān)鍵詞：硝基呋喃類代謝物；HPLC-MS/MS；質(zhì)譜參數(shù)；色譜柱

中圖分類號：TS254.7 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2017.06.029

硝基呋喃類藥物代謝物主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因等，它們具有潛在的致癌性和誘導(dǎo)有機體產(chǎn)生突變的性質(zhì)。目前，對硝基呋喃類藥物代謝物殘留的檢測主要有液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法。本研究基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度，簡要探討了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量及其不確定度評定情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

主要儀器有API300串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（產(chǎn)自美國ABI公司），配有電噴霧離子源（ESI源）和Agilent 1100 series高效液相色譜儀；Heraeus Biofuge Stratos臺式離心機；WH-866旋渦混合器；pH計；恒溫水浴振蕩器；電子天平；OA-SYSTM氮吹儀；勻漿機；超純水器；ZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm×5 μm）。

1.1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品有呋喃唑酮代謝物AOZ、呋喃它酮代謝物AMOZ、呋喃西林代謝物SEM、呋喃妥因代謝物AHD，它們均由德國Dr．E公司提供。衍生化試劑，稱取200 mg2-NBA（Sigma公司，德國）溶于12.5 mL的二甲亞礬中，現(xiàn)用現(xiàn)配。乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜級。定容液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的乙酸，即乙腈15∶85（V/V），鹽酸溶液（0.2 mol/L），氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L，1 mol/L）。

1.1.3 對蝦

對蝦樣品由水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心提供。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（0.5 mg/mL）配制

精密稱取硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)品AOZ，AMOZ，SEM，AHD用甲醇定容，4 ℃以下保存。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇和水按照1∶1的體積比稀釋至相應(yīng)濃度，4 ℃以下保存。

1.2.2 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品處理

具體操作時，可參照GB/T 21311—2007操作，即稱取2 g（精確至0.01 g）勻漿后的樣品于50 mL離心管中，加入物質(zhì)的量濃度為0.2 mol/L的鹽酸溶液20 mL和衍生化試劑1.0 mL，漩渦振蕩2 min，之后置于恒溫水浴振蕩器上37 ℃避光振蕩水解過夜（約16 h）。取出冷卻后，加入物質(zhì)的量濃度為0.5 mol/L的磷酸氫二鈉溶液1 mL，然后用物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5.之后加入乙酸乙酯10 mL，振搖1 min，4 000 r/min離心10 min，收集乙酸乙酯層，再用乙酸乙酯10 mL重復(fù)提取1次，合并乙酸乙酯層，50 ℃氮氣吹干，殘留物用1 mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%乙酸的1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的乙腈水溶液超聲溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，取40 μL進樣檢測。

1.3 HPLC-MS/MS檢測

1.3.1 HPLC條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，柱溫為35 ℃，梯度洗脫程序如表1所示。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），電噴霧電壓（IS）為5 500 V，霧化氣（NEB）參數(shù)為10，氣簾氣（CUR）參數(shù)為11，碰撞氣（CAD）參數(shù)為6，輔助氣（AUX）流速為8 L/min，輔助氣溫度（TEM）為475 ℃，去簇電壓（DP）為50 V，聚焦電壓（FP）為350 V，碰撞室出口電壓（CXP）為13.0 V，Q1、Q3均為單位分辨率（UNIT）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定方法的線性關(guān)系

采用內(nèi)標(biāo)法對定量離子對進行定量計算，將待測物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值作為橫坐標(biāo)，將待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值作為縱坐標(biāo)，建立線性關(guān)系。

當(dāng)待測物濃度在0.5～10.0 μg/kg的范圍內(nèi)時，4種硝基呋喃類代謝物均呈良好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)都在0.999以上。

2.2 樣品測定

按照上述方法和條件檢測樣品，得出的質(zhì)譜圖如圖1所示。

2.3 系統(tǒng)精密度

用所建立的檢測方法測定加標(biāo)的同一對蝦樣品，測定結(jié)果如表2所示。

2.4 回收率

以對蝦空白樣品為試驗材料，向空白樣品中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 μg/kg、1.0 μg/kg和5.0 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照上述方法進行水解衍生，提取凈化后用于測定，以內(nèi)標(biāo)法計算來驗證方法的回收率。回收率共測定4組，每組取3次重復(fù)的平均值，每次處理共測定12次。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)硝基呋喃類藥物分子的結(jié)構(gòu)特征，將ESI（+）作為電離模式，采用半自動進樣方式，分別用高質(zhì)量濃度（1.0 mg/mL）的AMOZ、SEM、AHD和AOZ及同位素內(nèi)標(biāo)物AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3和SCA-13C-15N2的標(biāo)準(zhǔn)溶液在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化，然后調(diào)節(jié)pH值至近7.4，再用乙酸乙酯萃取2次，氮氣吹干，然后用甲醇/水溶液（1∶1，V/V）溶解殘留物。接著以流動注射的方式在正離子模式下對4種代謝物和4種內(nèi)標(biāo)物的衍生化產(chǎn)物進行母離子全掃描，確定AMOZ、SEM、AHD、AOZ、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3和SCA-13C-15N2的m+1離子分別為m/z335，m/z209，m/z249，m/z236，m/z240，m/z340，m/z252和m/z212.然后分別將所得的m/z數(shù)作為母離子，對其子離子進行全掃描，并從中選取2個子離子。之后，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）優(yōu)化去簇電壓（DP）、聚焦電壓（FP）、碰撞氣（CAD）和碰撞能量（CE）等質(zhì)譜參數(shù)。結(jié)果顯示，以DP和CE對離子的豐度影響最大。接著用FIA方式繼續(xù)優(yōu)化霧化氣（NEB）、氣簾氣（CUR）、電噴霧電壓（IS）、輔助氣溫度（TEM）等參數(shù)。

3 小結(jié)

試驗表明，該方法在硝基呋喃類代謝物——呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（SEM）、呋喃妥因（AHD）的殘留測定中，表現(xiàn)出專屬性強、靈敏度高和準(zhǔn)確度高的特點。因此，它可作為分析水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的有效手段。

參考文獻

［1］趙東豪，黎智廣，王旭峰，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的優(yōu)化研究［J］.南方水產(chǎn)科學(xué)，2015，11（6）：58-64.

［2］周道志.水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測法的研究［J］.食品界，2016（6）：50-51.