1種簡單有效的根際土壤微生物DNA提取方法

鄭道君 +張冬明 吉清妹 +史珍萍 符傳良

摘要：研究了1種快速簡便地提取高質(zhì)量根際土壤DNA的改良十六烷基三甲基溴化銨（AB）法，應(yīng)用該方法能簡便快速地去除腐殖酸等干擾物質(zhì)，從而獲得高質(zhì)量的根際土壤DNA。所得DNA的D260 nm/D230 nm值為1.477±0121，以此DNA為模板，可以獲得帶條清晰、重復(fù)性高的相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性PCR（SRAP-PCR）擴(kuò)增結(jié)果。

關(guān)鍵詞：根際土壤；DNA提取；改良AB法；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性PCR（SRAP-PCR）

中圖分類號(hào)： S154.34文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0039-02

通過傳統(tǒng)分離方法獲得并進(jìn)行過研究的微生物種群數(shù)量只占自然界微生物總數(shù)的1%[1-2]，因此，采用培養(yǎng)的方法很難真實(shí)地反映土壤微生物的變化。近年來，不依賴于培養(yǎng)，直接從土壤中提取微生物總DNA進(jìn)行分析的一系列分子生態(tài)學(xué)研究技術(shù)因其研究結(jié)果具有快速、準(zhǔn)確、全面等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能及動(dòng)態(tài)監(jiān)測等方面的研究[3]。通過這些分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，土壤不再是黑箱，而是可以看得見、摸得著的系統(tǒng)，使得許多年以來土壤微生物學(xué)家所面臨的諸多問題可以得到解決。DNA的分離提取是分子生物學(xué)研究中重要的基本技術(shù)，從不同土壤中提取分離獲得純度較高的土壤DNA是進(jìn)行土壤微生物分子生態(tài)學(xué)研究的前提。本研究探索了1種簡單高效提取根際土壤DNA的改良十六烷基三甲基溴化銨（AB）法。

1材料與方法

1.1材料

土壤為取自海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與土壤研究所大棚的西瓜連作根際土壤，共連作3茬。每茬取樣1次，作為1份樣品。

1.2試劑與儀器

1.2.1主要試劑十六烷基三甲基溴化銨（AB）、三氯氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA），均為國產(chǎn)分析純。100 bp DNA ladder、Taq DNA聚合酶、4×dNTPs mix，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司產(chǎn)品。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）引物序列為正向引物Me1（5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′）、反向引物Em4（5′-GAGCGTACGAATTTGA-3′），生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

1.2.2主要儀器臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；溫水浴鍋；制冰機(jī)；移液槍；紫外分光光度計(jì)；T100 Thermal Cycler型PCR儀（美國Bio-Rad）；水平電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1取樣及樣品前處理（1）帶土挖出整株植物的根系，挖出時(shí)盡可能多帶些土；（2）輕輕抖去根系上大塊的土壤，剪取約15 g的帶土根系，置于裝有滅菌的0.86% NaCl溶液的25 mL離心管中，并快速帶回實(shí)驗(yàn)室；（3）將上述離心管放在冰中30 min，每隔5 min取出搖勻1次；（4）去掉植株根系，4 000 g、4 ℃低溫離心30 min，然后去除上清液。將所得土壤沉淀物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2土壤總DNA的提取（1）取上述土壤樣品約1.0 g于2.0 mL離心管中，置于液氮中3 min，再放入65 ℃水浴鍋中解凍2 min，反復(fù)進(jìn)行3次；然后在高通量組織研磨儀上用液氮研磨1 min，至粉未狀。（2）立即將上述粉末轉(zhuǎn)入65 ℃預(yù)熱的800 μL 3×AB提取液[100 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0），25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，2%硫基乙醇，3% AB]中，迅速混勻，置于65 ℃水浴約25 min，其間每隔 10 min 搖1次。（3）加入約等體積的三氯甲烷 ∶[KG-*3]異戊醇（24 ∶[KG-*3]1），90 ℃連續(xù)翻動(dòng)至渾濁而無2相，15 000 r/min離心5 min，取上清。重復(fù)此操作2次。（4）取上清液加入5 μL 10 mg/mL RNase溶液，搖勻，室溫下靜置10 min。（5）加入無水乙醇至離心管滿，此時(shí)馬上看到白色絮狀沉淀漂浮于上層乙醇中，切勿搖動(dòng)。用滅菌牙簽輕輕挑出白色絮狀DNA沉淀。然后吸出下層提取液于另1支離心管中，吸至2相混合面顏色較淡的液體時(shí)，將此液體連同上層乙醇丟棄。（6）重復(fù)第（5）步3次，并將最后3次所得DNA沉淀轉(zhuǎn)入同一離心管中，用70%乙醇清洗2次，晾干至DNA沉淀呈透明狀，再溶于120 μL無菌ddH2O中，于4 ℃保存?zhèn)溆没蜷L期保存于-20 ℃。

1.3.2DNA的質(zhì)量檢測用1.0%瓊脂糖凝膠檢測所提DNA的完整性；直接取100 μL用紫外分光光度計(jì)測定230、260、280 nm處的吸光度D230 nm、D230 nm、D230 nm，計(jì)算DNA的濃度，并估測DNA的純度。

1.3.3SRAP擴(kuò)增以上述提取的土壤總DNA為模板，進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以進(jìn)一步檢測所提DNA的質(zhì)量，反應(yīng)在iCyclerTM Thermal的Cycler型PCR儀上進(jìn)行。采用李春楠等優(yōu)化后的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序[4]。25 μL反應(yīng)體系組成：2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，1.0 U Taq酶，0.4 μmol/L引物，30 ng DNA模板，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 1 min，72 ℃ 120 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 120 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)重復(fù)1次。

PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠檢測，以100 bp DNA ladder 作為對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)（marker），在0.5×TBE緩沖液中，于5 V/cm的條件下電泳，在Gel Doc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)下照相并記錄結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1提取根際土壤DNA質(zhì)量

由圖1可見，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果無拖尾現(xiàn)象，表明所提DNA基本上無斷裂，完整性好。能夠有效去除腐殖酸是土壤DNA提取的關(guān)鍵。腐殖酸在230 nm處有1個(gè)吸收峰，可通過估算D260 nm/D230 nm值來確定所提取的DNA中腐殖酸的污染程度，D260 nm/D230 nm值越高，表明DNA純度越高；反之，表明腐殖酸污染越嚴(yán)重[5]。諸多學(xué)者報(bào)道土壤DNA提取法所獲得的DNA D260 nm/D230 nm值在1.3左右[6-8]。本研究所獲得的DNA D260 nm/D280 nm值在1.560～1.935之間，D260 nm/D230 nm值在

提取DNA的質(zhì)量會(huì)影響PCR是否能擴(kuò)增或擴(kuò)增的效果。在提取土壤DNA時(shí)，影響DNA質(zhì)量的主要是腐殖酸類物質(zhì)，這類物質(zhì)可以螯合Mg離子或與DNA或蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而抑制酶的活性[9]。為了驗(yàn)證本方法所提取的DNA中是否含有雜質(zhì)，采用SRAP擴(kuò)增的方法來判斷是否存在足以抑制Taq酶活性的抑制劑。由SRAP的擴(kuò)增結(jié)果（圖2）可見，本研究的DNA提取方法所提取的DNA完全可以用于SRAP-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條帶清晰，結(jié)果重復(fù)性高。綜上可見，本研究中所采用的DNA提取法是1種可以有效減少腐殖酸類物質(zhì)的方法，用該法所提DNA幾乎不含有酶抑制物等影響PCR反應(yīng)的雜質(zhì)。

2.2根際土壤DNA提取效率

經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)檢測，4份樣品所提取的DNA濃度分別為0.062 8、0.103 2、0.056 9、0.049 5 μg/μL。經(jīng)計(jì)算，用本方法所提取根際土壤DNA的產(chǎn)量為5.94～12.384 μg/g，這與張海燕等建立的方法獲得的DNA產(chǎn)量[10]相當(dāng)，較陳旭玉等建立的方法獲得DNA產(chǎn)量[8]高。此外，本研究所建立的方法步驟簡單，僅需6個(gè)步驟即可完成，需時(shí)1.0～1.5 h。可見本方法為操作簡單、效率較高的土壤DNA提取方法。

3討論

土壤微生物的種群和數(shù)量極易隨著環(huán)境條件的變化而變化，因此為了確保所獲得的研究結(jié)果能真實(shí)反映土壤微生物信息，在取樣過程中既要迅速，又要砌底。可見取樣過程是極為重要的，但也是常被研究者忽略的。為了正確與迅速取樣，在本研究中，抖去根系大塊土壤后直接將土壤置于裝有滅菌的0.86% NaCl溶液的25 mL離心管中，并快速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品預(yù)處理。根際土壤微生物在鹽溶液中置于冰上 30 min，每隔5 min取出搖勻1次，這樣既降低了土壤微生物的種群、數(shù)量的變化，減少在樣品取樣過程中的污染，同時(shí)也可使部分腐殖酸等雜質(zhì)溶于0.86% NaCl溶液而得以去除。為了達(dá)到去除腐殖酸的目的，諸多學(xué)者對(duì)土壤樣品進(jìn)行了預(yù)處理，王澍等采用CaCO3溶液和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）磷酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理[11]；趙勇等在微生物細(xì)胞裂解前采用TENP緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)土壤樣品進(jìn)行了2次洗滌處理[7]；徐巖等采用2%磷酸緩沖液（pH值8.0，含2% PVP）對(duì)土壤樣品洗滌處理用鹽溶液低溫振蕩懸浮處理也有效去除了部分腐殖酸類物質(zhì)。

在細(xì)胞裂解釋放DNA時(shí)，不同的學(xué)者采用了2×AB提取液、溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉（SDS）裂解液對(duì)土壤樣品進(jìn)行處理。本研究則采用反復(fù)凍溶和3×AB提取液以使細(xì)胞壁充分裂解，并適當(dāng)提高NaCl濃度（2.0 mol/L）以使DNA充分溶解，從而達(dá)到提高DNA產(chǎn)量的目的。在土壤DNA提取時(shí)，影響DNA質(zhì)量的主要是腐殖酸類物質(zhì)。這類物質(zhì)主要通過影響PCR酶的活性致使PCR擴(kuò)增失敗。本法在沉淀DNA時(shí)，白色絮狀DNA沉淀漂浮于上層無水乙醇中，快速挑出DNA沉淀，使之未與下層液體接觸，因而能避免由于腐殖酸類物質(zhì)等原因給DNA質(zhì)量造成的影響。

目前所報(bào)道的土壤DNA提取方法中，為了獲得更多的DNA沉淀，多數(shù)是用預(yù)冷的無水乙醇或異丙醇沉淀DNA，并置于-20 ℃、30 min左右。這種方法雖然可以避免DNA斷裂并可獲得更多的DNA沉淀，但是低溫可能會(huì)使AB溶液產(chǎn)生沉淀而影響后續(xù)工作。例如，導(dǎo)致DNA沉淀較難溶解和有AB殘留，從而可能會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生影響。此外，長時(shí)間的沉淀會(huì)使更多的腐殖酸類物質(zhì)隨之沉淀而嚴(yán)重影響DNA質(zhì)量。利用本方法所提取的DNA雖然濃度稍低，但可以有效去除腐殖酸等物質(zhì)的干擾。同時(shí)本方法具有操作相對(duì)簡單、整個(gè)過程所用時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是1種簡易快速獲得高質(zhì)量DNA的提取方法。[LL]

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