Morris水迷宮訓(xùn)練對(duì)老年癡呆大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織腫瘤壞死因子-α、超氧化物歧化酶、丙二醛水平的影響

彭 璇 吳 剛 吳 昊 黃德斌

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

Morris水迷宮訓(xùn)練對(duì)老年癡呆大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織腫瘤壞死因子-α、超氧化物歧化酶、丙二醛水平的影響

彭 璇 吳 剛1吳 昊 黃德斌

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

目的 觀察Morris水迷宮訓(xùn)練對(duì)老年癡呆(AD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織腫瘤壞死因子(TNF)-α、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影響。方法 隨機(jī)將32只SD雄性大鼠分為假手術(shù)組、模型組、Morris水迷宮短期訓(xùn)練組和Morris水迷宮長(zhǎng)期訓(xùn)練組；以穹隆-海馬傘切斷建立癡呆大鼠模型；運(yùn)用Morris水迷宮進(jìn)行訓(xùn)練；采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)以及水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定大鼠海馬組織TNF-α的水平，比色法檢測(cè)大鼠海馬組織SOD活性和MDA含量。結(jié)果 Morris水迷宮訓(xùn)練后AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高(P<0.01)；大鼠海馬區(qū)TNF-α、MDA含量明顯降低(P<0.05)、SOD含量明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 Morris水迷宮訓(xùn)練能明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與提高海馬區(qū)SOD含量、降低TNF-α和MDA水平有關(guān)，而且水迷宮訓(xùn)練時(shí)間越長(zhǎng)，恢復(fù)越明顯。

Morris水迷宮訓(xùn)練；癡呆；學(xué)習(xí)和記憶能力；大腦海馬

老年癡呆(AD)致死率僅次于心血管疾病、惡性腫瘤與腦卒中，高居全球死亡率的第四位〔1〕，其防治問題也成了當(dāng)今需要解決的重大公共衛(wèi)生難題。研究表明，體力與腦力活動(dòng)量的增加有助預(yù)防AD〔2,3〕。而英國(guó)臨床心理學(xué)家Morris于1984年設(shè)計(jì)出用于研究大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的裝置——Morris水迷宮(MWM)〔4〕，該裝置主要針對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶、智力與衰老、AD、行為生物學(xué)等方面的研究。基于此，本研究通過穹窿-海馬傘損傷法制備AD模型，觀察水迷宮訓(xùn)練對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，檢測(cè)海馬組織腫瘤壞死因子(TNF)-α水平、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，擬從自由基代謝方面來探討水迷宮訓(xùn)練防治AD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取32只12個(gè)月齡雄性SD大鼠，體重400～450〔平均(420±20)〕g，均來源于湖北民族學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)其進(jìn)行為期1 w的適應(yīng)性訓(xùn)練(溫度20℃，濕度70%)。經(jīng)MWM測(cè)試篩選，將不合格大鼠剔除，剩余32只合格大鼠，按照隨機(jī)平均原則，分為模型組、假手術(shù)組、長(zhǎng)期訓(xùn)練組和短期訓(xùn)練組。實(shí)施實(shí)驗(yàn)后，不對(duì)模型組開展訓(xùn)練刺激，其他同假手術(shù)組。MWM長(zhǎng)期、短期訓(xùn)練組造模后與造模前訓(xùn)練方法一致同，長(zhǎng)期訓(xùn)練組：造模后第6天，開展為期40 d的訓(xùn)練；短期訓(xùn)練組：造模后第26天，開展為期20 d的訓(xùn)練。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 MDA試劑盒(上海信裕生物技術(shù)有限公司)，SOD試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海信然生物技術(shù)有限公司)；Hans水迷宮訓(xùn)練儀(廣州飛迪生物科技有限公司，型號(hào)XR-XM101)；MWM及水迷宮記錄分析系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制,型號(hào)：DigBehv-MR);Ultra-TurraxT25勻漿機(jī)(德國(guó)JANKE-KUNKEL公司)；顱腦立體定位儀(天津市醫(yī)療器械研究所)；牙科鉆(上海嶺之崎精密工具公司)大鼠跳臺(tái)儀(中國(guó)醫(yī)科院藥物研究所，型號(hào)：DTT-2)；微電極腦立體定位儀(西北光明儀器廠，型號(hào)：WDT-11)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物水迷宮訓(xùn)練 MWM操作系統(tǒng)：水桶注入清水到預(yù)定水池高度(距桶面5 cm)，放入適量黑色碳素墨水，使水面渾濁至不透明，將桶內(nèi)水溫加熱到23℃～25℃，把水池平均分為四個(gè)象限，即：東北、西北、西南、東南，并將站臺(tái)固定在四個(gè)象限中心位置，其圓心距為23 cm，浸于水池液平面下3 cm。先將 AD 模型鼠放入水池中，不在平臺(tái)位置投放，進(jìn)行為期3 min的自由游泳，目的在于熟悉迷宮內(nèi)的環(huán)境；再將大鼠頭面向池壁，以四個(gè)象限為核心，在其中部池壁的位置，將大鼠輕放到水池，使其自行尋找站臺(tái)位置。每天訓(xùn)練兩個(gè)時(shí)段(間隔6 h)，每段對(duì)其訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練間隔時(shí)間為60 min。訓(xùn)練時(shí)，將大鼠面向池壁隨機(jī)放入水池內(nèi)任一入水點(diǎn)，如果大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)(120 s)未游入平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)停留20 s，再放回籠中,此時(shí)逃避潛伏期就記為120 s。在第41天，將各組大鼠再次按照以上方法進(jìn)行為期5 d的空間學(xué)習(xí)記憶能力訓(xùn)練，再測(cè)量潛伏期，即大鼠尋找并爬上平臺(tái)時(shí)所需時(shí)間，并觀察大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)記憶的獲取能力、撤去平臺(tái)后在120 s內(nèi)跨過原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)，即定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

1.3.2 跳臺(tái)試驗(yàn) 設(shè)置體積為15 cm×30 cm×30 cm的被動(dòng)回避反應(yīng)箱作為跳臺(tái)試驗(yàn)裝置，箱內(nèi)放置一個(gè)橡膠圓臺(tái)作為安全范圍，動(dòng)物可停留在安全范圍內(nèi)逃避電擊。裝置完畢后，將大鼠放入箱內(nèi)120 s，使其適應(yīng)環(huán)境，40 V交流電通入，計(jì)時(shí)從大鼠跳入安全范圍內(nèi)開始，到大鼠再次從安全臺(tái)跳下(潛伏期時(shí)間)，同步記錄300 s內(nèi)大鼠跳出安全范圍被電擊的次數(shù)，將被點(diǎn)擊次數(shù)記為錯(cuò)誤次數(shù)。所有大鼠于造模后5 d、造模后46 d(水迷宮訓(xùn)練刺激結(jié)束后)開展跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

1.4 化學(xué)指標(biāo)測(cè)定及結(jié)果判定 腹腔麻醉選取10%水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的劑量，麻醉完畢后斷頭，在操作臺(tái)上迅速分離出海馬組織。根據(jù)1 g海馬組織樣，加入4℃預(yù)冷的生理鹽水，13 500 r/min離心，低溫勻漿時(shí)間10 s/次，間隔30 s，連續(xù)4次，制備出10%的組織勻漿，后低溫低速(4℃，3 000 r/min)離心15 min，取上清液，-40℃保存。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織蛋白含量；海馬區(qū)炎性因子TNF-α含量水平采用ELISA測(cè)定；海馬組織勻漿中SOD和MDA含量用比色法檢測(cè)。上述測(cè)定根據(jù)相關(guān)試劑盒說明書的步驟進(jìn)行嚴(yán)格操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)法測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 造模后5 d，模型組、短期訓(xùn)練組、長(zhǎng)期訓(xùn)練組大鼠跳臺(tái)潛伏時(shí)間較假手術(shù)組顯著縮短(P<0.01)；造模后46 d，模型組雖然較假手術(shù)組有所降低，但是還是較造模后5 d時(shí)有所延長(zhǎng)(P<0.05)，長(zhǎng)期訓(xùn)練組較造模后5 d顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。見表1。造模后5 d，模型組、短期訓(xùn)練組、長(zhǎng)期訓(xùn)練組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的錯(cuò)誤次數(shù)較假手術(shù)組顯著增多(P<0.01)；造模后46 d，模型組與假手術(shù)組相比，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，但與造模后5 d相比還是有所減少(P<0.05)，短期訓(xùn)練組與模型組相比，錯(cuò)誤次數(shù)明顯降低(P<0.05)，長(zhǎng)期訓(xùn)練組與模型組相比，錯(cuò)誤次數(shù)有顯著降低(P<0.01)。見表2。

表1 大鼠跳臺(tái)潛伏時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與本組5 d比較：3)P<0.05

表2 各組大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的錯(cuò)誤次數(shù)比較±s，次，n=8)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與本組5 d比較：4)P<0.05

2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 造模46 d后，模型組大鼠的逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；長(zhǎng)期訓(xùn)練組較模型組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，而短期訓(xùn)練組其逃避潛伏期也有所縮短，但無顯著差異(P>0.05)。模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于假手術(shù)組(P<0.01)，長(zhǎng)期訓(xùn)練組與模型組相比，次數(shù)增加尤為明顯(P<0.01)。見表3。

2.3 水迷宮訓(xùn)練對(duì)AD大鼠海馬區(qū)TNF-α、MDA和SOD含量的影響 造模后46 d，模型組TNF-α較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)，長(zhǎng)、短期訓(xùn)練組與模型組相比明顯降低(P<0.05)。模型組MDA較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，短期訓(xùn)練組、長(zhǎng)期訓(xùn)練組與模型組相比都明顯降低(P<0.05)，長(zhǎng)期訓(xùn)練組與短期訓(xùn)練組相比有明顯降低(P<0.05)。模型組SOD活性較假手術(shù)組明顯降低(P<0.05)；長(zhǎng)期訓(xùn)練組SOD活性較模型組明顯升高(P<0.05)，較短期訓(xùn)練組明顯升高(P<0.05)。見表4。

表3 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)記憶能力比較±s,n=8)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01，與模型組比較:2)P<0.01

表4 各組大鼠海馬區(qū)TNF-α、MDA和 SOD含量的比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05；與短期訓(xùn)練組比較：4)P<0.05

3 討 論

原發(fā)性AD作為一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力、思維能力、感覺能力、記憶力、判斷力等降低。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確。有研究顯示〔5〕，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的最主要組成部分之一，海馬組織參與了大腦信息貯存、記憶等重要功能，并在學(xué)習(xí)、記憶以及情緒應(yīng)激過程中扮演了不可替代的角色。本研究采用穹窿-海馬傘損傷法制備的AD動(dòng)物模型〔6〕，能在一定程度上模擬AD，造成大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的損害、乙酰膽堿等生化遞質(zhì)的改變，海馬神經(jīng)細(xì)胞等一系列AD的病理改變，這對(duì)于研究AD的早期過程和預(yù)防治療具有一定的說服力和代表性，可用于監(jiān)測(cè)AD海馬區(qū)炎癥介質(zhì)含量和功能的變化。

本研究提示水迷宮訓(xùn)練可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等途徑對(duì)抗海馬損傷，改善認(rèn)知功能，對(duì)AD的防治起到一定的作用。老年人經(jīng)常從事腦力勞動(dòng)，可增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力，有效防治AD。這種改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用可能與增強(qiáng)動(dòng)物海馬部位SOD含量，減少炎癥介質(zhì)TNF-α和膜脂質(zhì)過氧化物MDA的水平以及發(fā)揮抗氧化的作用有關(guān)。在臨床中，通過對(duì)AD、帕金森、腦血管疾病患者進(jìn)行智力訓(xùn)練，可明顯改善癥狀〔7〕。TNF-α作為一種重要的炎癥介質(zhì)，能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧簇(ROS);而補(bǔ)體受體又可以同超氧自由基反應(yīng)生成MDA，后者介導(dǎo)膜脂質(zhì)過氧化，損傷血腦屏障及腦細(xì)胞膜。因此，增多的炎癥介質(zhì)可透過損傷的血腦屏障及受損的細(xì)胞膜，進(jìn)一步加重其他因子引起的氧化應(yīng)激和神經(jīng)退化〔8〕，從而形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死，促進(jìn)AD病情的加重。

綜上，穹窿-海馬傘損傷誘導(dǎo)AD大鼠的模型可通過增加炎癥介質(zhì)TNF-α造成大鼠海馬區(qū)的氧化應(yīng)激損傷，水迷宮訓(xùn)練能夠增加SOD的活性〔9〕，具有抗氧化效應(yīng)，有利于清除血液和腦組織中氧自由基，減輕海馬神經(jīng)元損傷，保護(hù)海馬神經(jīng)元，維系膽堿能神經(jīng)的可塑性。這可能是改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制之一。水迷宮訓(xùn)練具有較好的改善機(jī)體自由基代謝的作用，使機(jī)體的抗氧化能力增強(qiáng)，從而減輕突觸超微結(jié)構(gòu)損傷，其改善AD大鼠記憶、學(xué)習(xí)能力可能與此有關(guān)。

1 李 昂，殷淑琴，徐 勇，等.2010-2030年中國(guó)老年期癡呆的預(yù)測(cè)〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2015;35(13):3708-11.

2 劉 爽,張玉蓮，周 震.老年性癡呆流行病學(xué)研究現(xiàn)狀〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2010;30(10):1455-8.

3 Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat〔J〕.J Neurosci Methods,1984;11(1):47-60．

4 Morris RGM.Spatial localization does not require the presence of local cues〔J〕.Learn Motiv,1981;12:239.

5 王緒平，咼登俊，陳 宇,等.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)血管性癡呆大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013;31(1):99-101.

6 陶 莉,王 詩,謝劍梅,等．蘆薈大黃素對(duì)癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善研究〔J〕.現(xiàn)代食品科技,2014;30(12):7-10.

7 方 松,余化霖.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中海馬相關(guān)空間學(xué)習(xí)記憶的研究進(jìn)展〔J〕.國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2010;30(4):321-5.

8 張靜爽,王 蓉.阿爾茨海默病發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014;35(6):721-5.

9 Shema R,Sacktor TC,Dudai Y.Rapid erasure of long-term memory associations in the cortex by an inhibitor of PKM zeta〔J〕.Science,2007;317(5840):951-3.

〔2015-12-27修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

Influence of Morris water maze training on Azheimer's disease rats learning and memory ability and the expressions of TNF-α,SOD and MDA in hippocampal tissue

PENG Xuan,WU Gang,WU Hao,etal.

Medical College of Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,Hubei,China

Objective To investigate the protective effect of water maze training on Alzheimer,s disease (AD)rats.Methods 32 SD rats were randomly divided into sham,model,short-term Morris water-maze training (short-term) and long-term Morris water-maze training (long-term) groups.Rat model of AD was made by transection of rat fimbria-fornix.Rats in these groups were tested for spatial learning and memory ability in Step-down Test and Morris water maze.Then,the brains were removed and hippocampal homogenate were prepared.Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was adopted to measure the level of TNF-α,colorimetric method was used to detect the content of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in the hippocampus homogenate.Results Morris water-maze training,learning and memory ability of AD rat was increased obviously,TNF-α and MDA were reduced,SOD was increased in hippocampal homogenate(P<0.05).Conclusions Water maze training can improve the spatial learning and memory ability of AD rats made by transaction of fimbria-fornix by enhancing the content of SOD and reducing TNF-α and MDA levels,and longer training and better effect.

Morris water maze training;AD;Learning and memory ability;Hippocampus

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360654)

吳 剛(1969-)，男，碩士，講師，主要從事神經(jīng)解剖學(xué)研究。

彭 璇(1981-)，女，在讀博士，副教授，主要從事分子病理生理學(xué)研究。

R73-3

A

1005-9202(2017)08-1833-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.005

1 湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室