苦參總堿對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

樊美玲 劉 博 王 鑫 溫富春 丁 濤 紀鳳蘭 徐惠波

(吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130012)

苦參總堿對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

樊美玲 劉 博 王 鑫 溫富春 丁 濤 紀鳳蘭 徐惠波

(吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130012)

目的 利用心肌缺血再灌注損傷致大鼠心肌細胞凋亡模型研究苦參總堿(TASF)對心肌細胞的保護作用。方法 80只雄性大鼠隨機分組，連續給藥7 d，末次給藥1 h后除空白組動物外，其余動物結扎左冠脈前降支30 min，再灌注6 h，通過血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門天冬氨酸氨基轉移酶(AST)，心肌病理學、電鏡、TUNEL染色及Bcl-2、Bax蛋白表達的檢測對TASF保護心肌的作用進行評估。結果 與模型組相比，80 mg/kg TASF能夠有效降低血清中CK、LDH、AST的含量(P<0.05)，40 mg/kg TASF能夠有效降低血清中LDH、AST的含量(P<0.05)；80 mg/kg和40 mg/kg TASF能夠減少缺血再灌注導致的心肌細胞結構的破壞；80 mg/kg TASF可以減少缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡(P<0.05)，其機制可能與增加Bcl-2蛋白的表達，降低Bax蛋白表達有關。結論 TASF對心肌缺血再灌注引起的心肌細胞損傷具有保護作用，其機制可能為調控Bcl-2、Bax基因表達抑制心肌細胞凋亡。

苦參總堿；缺血再灌注損傷；凋亡；心肌保護

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)可通過氧自由基損傷、鈣超載等多種機制對心肌細胞造成損傷，同時在此過程中，均可以引起較為嚴重的心律失常。苦參總堿(TASF)是苦參的主要活性成分之一，其藥理活性主要為抗心律失常、抗病毒，抗腫瘤等。心律寧片是TASF的中成藥制品，臨床上主要用于抗各種原因引起的心律失常的治療，對于冠心病等缺血性疾病引起的心律失常也有較好的療效〔1〕，但對于缺血再灌注過程中心肌保護等作用報道較少。本實驗通過大鼠心肌缺血再灌注致心肌細胞凋亡模型觀察TASF對心肌細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠，80只，體重300～350 g，購于長春億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號：SCXK(吉)-2011-0004，動物許可證號：201500009838，201500009913，201500009998，2015000010032，201500010077，201500010697；飼養環境設施合格證：SYXK(吉)2015-0009。

1.2 藥品 心律寧片，酒泉大得利制藥有限公司生產，批號：150404。地奧心血康膠囊，成都地奧制藥集團有限公司生產，批號：1501065。

1.3 主要試劑與儀器 烏來糖，國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：T20100310；肌酸激酶(CK，批號：150891)、乳酸脫氫酶(LDH，批號：160581)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST，批號：151221)測定試劑盒，均為中生北控生物科技股份有限公司生產；Bcl-2(N-19，貨號：sc-492，批號：G1315)、Bax (B-9，貨號：sc-7480，批號：H1215)、山羊抗兔IgG-HRP，山羊抗鼠(貨號：sc-2004，批號：F2215)、山羊抗鼠IgG-HRP(貨號：sc-2005，批號：H0415)；均為Santa Cruz Biotechnology Inc生產；In Situ Cell Death Detection Kit，Roche公司生產，批號：10768100。PowerLab/8S型多導生物記錄儀，AD Instruments公司生產；IMS-40型雪花形制冰機，常熟市雪科電器有限公司生產；ELx800酶標儀，BioTek Instruments,Inc生產；DYY-6C六一電泳儀，北京市六一儀器廠生產；GF-D800型半自動生化分析儀，山東高密彩虹分析儀器有限公司生產；RM2255型高精密全自動切片機，德國徠卡。

1.4 實驗方法 雄性Wistar大鼠80只(每組10只)，隨機分為空白組、MIRI模型組、地奧心血康組(120 mg/kg)、80 mg/kg TASF組、40 mg/kg TASF組、20 mg/kg TASF組。連續給藥7 d，末次給藥1 h后，烏來糖1.2 g/kg腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術臺上，切開氣管接人工呼吸機供開胸后進行人工呼吸，連接八道生理記錄儀連續觀察和記錄心電圖。在胸左側第四五肋間處切開胸壁并沿胸骨左緣2 mm處切斷第四和第五肋骨，用拉鉤擠出心臟，從左心耳下方2 mm處進針，斜穿過左冠狀動脈前降支下心肌，從肺動脈圓錐左緣出針，然后將心臟還回胸腔中，待恢復10～20 min，T波恢復后，將直徑2 mm、長4 cm的塑料管與左冠狀動脈前降支平行放置，用穿過冠狀動脈的絲線將冠狀動脈和塑料管一起接扎，造成心肌缺血，以ECGⅡ導聯ST段明顯提高作為結扎成功的標志。心肌缺血30 min后剪斷結扎線，取下塑料管，恢復冠狀動脈血流6 h。空白組開胸穿線，不結扎左冠狀動脈，整個試驗過程中連續記錄Ⅱ導聯心電圖。實驗結束后腹主動脈采血，離心分離血清-80℃保存，進行CK、LDH、AST等心肌酶的檢測；取心臟，心尖用2.5%的戊二醛溶液固定進行電鏡檢測，其余心臟分為兩份，一份10%甲醛溶液固定做病理檢查光鏡一般病理學和TUNEL染色，另一份液氮保存Western印跡法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 TASF對MIRI大鼠血清CK、LDH、AST含量的影響 與空白組相比，模型組動物血清中的CK、LDH、AST含量顯著升高(P<0.001，P<0.01)。與模型組相比，地奧心血康120 mg/kg能夠降低MIRI大鼠血清CK的含量(P<0.01)；80 mg/kg TASF能夠降低血清中的CK、LDH、AST含量(均P<0.05)；40 mg/kg TASF能夠降低血清中的LDH、AST含量(均P<0.05)。見表1。

2.2 TASF對MIRI大鼠心肌組織一般病理學的影響 空白組心臟組織結構正常，結構清晰，未見纖維結締組織增生，未發現異常，未見炎細胞浸潤。模型組心臟可見心肌纖維間質水腫，心肌間質疏松，少量局部心肌間質內可見淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。局部心肌可見肌凝、肌溶解，心肌壞死，心肌間質內可見炎細胞浸潤，心肌間質出血。地奧心血康組內心肌細胞間質內出血減少，心肌細胞局部染色不均。80 mg/kg TASF組心肌細胞間質出血減少，少見炎細胞浸潤，效果優于地奧心血康組。40 mg/kg TASF組心肌細胞少見染色不均，總體效果與之相似。20 mg/kg TASF組心肌細胞可見心肌細胞壞死，心肌可見多處染色不均，可見輕微炎細胞滲出，間質出血，顯示TASF各組病理結果表現優于模型組。見圖1。

2.3 TASF對MIRI大鼠心肌細胞結構的影響 在電鏡下觀察，空白組心肌細胞排列整齊，閏盤正常，肌絲束，肌節結構清晰，線粒體縱行排列在肌絲束之間。與空白組相比，模型組的心肌細胞呈高度不規則形，周圍肌絲大部分消失，肌節結構不清；線粒體增生腫脹，空化嚴重。可見模型組的心肌細胞結構損傷比較嚴重。地奧心血康組心肌細胞肌節明暗帶清晰，局部線粒體增多，致密，個別線粒體嵴斷裂，基質空化，并有脂滴夾雜在肌絲中。 80 mg/kg TASF組肌絲束上肌節結構清晰，局部線粒體增多且致密，表現與地奧心血康組類似。40 mg/kg TASF組肌絲束排列整齊，肌節結構清晰可辨，線粒體結構和數量正常，表現較為接近空白組。20 mg/kg TASF組肌絲束排列紊亂、斷裂，肌小節結構不清，明帶消失，Z線增粗，線粒體大量增生，腫脹，空化嚴重，表現類似于模型組。見圖2。

表1 TASF對MIRI大鼠血清CK、LDH、AST含量及心肌細胞凋亡的影響

與空白組比較：1)P<0.01，2)P<0.001；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

圖1 TASF對MIRI大鼠心肌病理學的影響 (HE，×400)

圖2 TASF對MIRI大鼠心肌細胞結構的影響(×10 000)

2.4 TASF對MIRI大鼠心肌組織細胞凋亡TUNEL染色的影響 與空白組相比，模型組心肌細胞凋亡明顯增加(P<0.001)。與模型組相比，120 mg/kg地奧心血康和80 mg/kg TASF能夠明顯降低心肌細胞凋亡率(P<0.05)。見表1，圖3。

圖3 TASF對MIRI大鼠心肌細胞凋亡的 影響 (TUNEL，×400)

2.5 TASF對MIRI大鼠心肌組織Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 與空白組相比，模型組的Bcl-2表達降低，Bax表達增加(P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，80 mg/kg TASF能明顯增加Bcl-2蛋白表達(P<0.05)。120 mg/kg 地奧心血康和40 mg/kg TASF有一定增加的趨勢；120 mg/kg地奧心血康、80 mg/kg和40 mg/kg TASF組能降低心肌中Bax蛋白的表達(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。見圖4，表2。

1～6:空白組、模型組、地奧心血康組、80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg TASF組圖4 TASF對MIRI大鼠心肌組織Bcl-2和Bax表達的影響表2 TASF對MIRI大鼠心肌組織Bcl-2和 Bax表達相對灰度的影響

組別Bcl-2Bax空白組100.0±0.00100.0±0.00模型組75.0±11.191)131.8±5.902)地奧心血康組97.1±18.44102.9±7.084)80mg/kgTASF組127.4±26.263)101.9±4.754)40mg/kgTASF組117.3±28.84110.2±13.733)20mg/kgTASF組110.2±32.30130.6±21.10

3 討 論

急性心肌缺血是冠心病的主要病理生理表現，表現為心肌組織、器官供血中斷，一定時間內再恢復血供，缺血組織、器官不僅功能沒有恢復，反而使功能障礙和結構損傷進一步加重。MIRI是急性心肌梗死后再灌注治療中常出現的病理過程，目前認為其造成心肌損傷的機制主要是能量代謝障礙、活性氧增加，鈣超載等引起心肌細胞功能和結構的障礙最終影響心臟的泵血功能〔2,3〕。此外，在心肌缺血和再灌注的過程中，可引起心臟電生理活動的異常，導致嚴重的心律失常，是冠心病患者死亡的主要原因之一。

TASF是中藥苦參的主要活性成分之一，目前已分離出的生物堿多達20多種，其中具有藥理活性的主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐胺堿、槐定堿。其主要的藥用活性成分苦參堿及氧化苦參堿均有抗心律失常的作用，且具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用。TASF目前已被開發成多種劑型的中成藥并在臨床上用于抗心律失常、抗腫瘤、抗炎的治療。心律寧片是TASF的中成藥制品，臨床上主要用于抗各種原因引起的心律失常的治療，對于冠心病等缺血性疾病引起的心律失常也有較好的療效，但對于缺血再灌注過程中心肌保護等作用報道較少。CK、LDH和AST是反映心肌細胞損傷的一般性指標，本研究結果顯示TASF具有在MIRI中保護心肌細胞的作用。通過光鏡觀察心肌的大體結構及電鏡直接觀察心肌細胞的超微結構也提供了TASF保護心肌細胞的證據。凋亡是多基因嚴格控制的過程，隨著分子生物學技術的發展對多種細胞凋亡的過程有了相當的認識，但是迄今為止凋亡過程確切機制尚不完全清楚。目前認為其與多種基因表達有關，如Bcl-2家族、caspase家族等〔4～8〕。MIRI與細胞凋亡也有著密切的關系，MIRI過程中可導致Fas/FasL系統、抑癌基因P53、MAPK、PI3K/PKB、JAK/STAT等多種信號通路的異常，啟動心肌細胞凋亡的級聯反應，引起心肌細胞凋亡〔9〕。大量心肌細胞凋亡最終導致心功能障礙。Bcl-2和Bax是目前比較公認的一對調控凋亡的基因，Bcl-2的表達抑制凋亡，而Bax表達則促進細胞凋亡〔10〕。本研究結果顯示，TASF能夠增加MIRI動物模型心肌中Bcl-2蛋白的表達，并抑制Bax蛋白的表達，提示其抑制心肌細胞凋亡可能與調控Bcl-2和Bax基因的表達有關。

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3 孔令恒，劉 哲，張建英,等.心肌缺血-再灌注-鈣超載損傷的基礎與臨床研究〔J〕.中國體外循環雜志，2015；13(4):253-6.

4 屈朝法，馬禮坤，徐少東,等.心肌缺血-再灌注-鈣超載損傷的基礎與臨床急性心肌梗死晚期再灌注后心肌細胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達的研究〔J〕.中國病理生理雜志，2007;23(4):656-9.

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10 鄭曙云,徐建國,李 明.參附注射液對大鼠心肌缺血再灌注細胞凋亡的影響〔J〕.南京大學學報(自然科學)，2004;40(2):192-8.

〔2016-12-31修回〕

(編輯 曹夢園)

吉林省科技發展計劃項目(20140522040JH)

徐惠波(1963-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事心腦血管藥理研究。

樊美玲(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事中醫內科基礎與臨床研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1840-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.008