槲皮素對(duì)人成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響

詹雪芬 司鶴南 姚海舟 田亞萍

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

槲皮素對(duì)人成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響

詹雪芬 司鶴南1姚海舟2田亞萍1

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

目的 探討槲皮素對(duì)人成纖維細(xì)胞(HSF)生長及膠原分泌能力的影響。方法 原代培養(yǎng)HSF，并以不同濃度的槲皮素干預(yù)24 h，以MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，以流式細(xì)胞術(shù)測定其細(xì)胞周期，對(duì)培養(yǎng)上清用堿水解法測定其中羥脯氨酸(Hyp)含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)及透明質(zhì)酸(HA)含量。結(jié)果 槲皮素作用HSF 24 h后，與對(duì)照組比較，槲皮素各劑量組細(xì)胞處于增殖期的細(xì)胞數(shù)目、增殖能力逐漸增加(P<0.05)，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；不同濃度槲皮素作用于HSF 24 h后，培養(yǎng)上清中Hyp、Col Ⅰ及HA含量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論 槲皮素可促進(jìn)HSF增殖、刺激其分泌膠原及HA，對(duì)維持皮膚彈性、減少皮膚皺紋形成、延緩衰老有重要意義。

槲皮素；人成纖維細(xì)胞

人皮膚真皮層主要由人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)及其分泌的基質(zhì)構(gòu)成，對(duì)維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用。真皮中HSF的老化及其調(diào)控代謝的基質(zhì)退行性變化，是造成皮膚出現(xiàn)皺紋、松弛、僵硬等老化現(xiàn)象的最直接原因〔1〕。真皮中的基質(zhì)主要由膠原纖維(膠原)構(gòu)成，其主要生化成分是Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)和透明質(zhì)酸(HA)，是評(píng)價(jià)皮膚老化機(jī)制的重要指標(biāo)。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，化學(xué)名為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮，具有抗氧化及清除自由基的作用，近年來其抗衰老價(jià)值逐漸引起學(xué)者的重視〔2〕。本研究旨在探討槲皮素對(duì)HSF生長及膠原分泌能力的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 槲皮素(Q4951)、MTT、碘化丙啶(PI，sigma公司)；羥脯氨酸(Hyp)測定試劑盒(A030-1，南京建成生物工程研究所)；人 Col I試劑盒(E-EL-H0130)、人HA試劑盒(E-EL-H0130)；HA(E-EL-0036，Elabscience 公司)；RPMI-1640、血清(Invitrogen公司)。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 人皮膚原代成纖維細(xì)胞(HSF)的培養(yǎng)、傳代及鑒定〔2〕健康男子包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮，經(jīng)無菌pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)漂洗、去除多余結(jié)締組織后，置0.25%胰蛋白酶溶液中4℃孵育過夜。次日取出皮膚后，刮去表皮和皮下肌肉及脂肪組織，將保留的真皮組織剪碎，置0.25%膠原酶Ⅳ中37℃孵育4 h。消化液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心15 min，棄上清，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕吹打沉淀，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并接種至培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2靜止培養(yǎng)3 d后，若細(xì)胞貼壁良好，則以后隔日換液，至細(xì)胞生長匯合率達(dá)90%以上時(shí)，按1∶3傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞傳代至第3代時(shí)進(jìn)行鑒定。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力的測定 以MTT法檢測細(xì)胞增殖能力：將處于對(duì)數(shù)生長期的HSF以 1×102/L細(xì)胞密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁后，換用含不同濃度槲皮素(12.5、25、50 μmol/L)的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以正常無血清RPMI-1640培養(yǎng)液作為對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μl、5 mg/ml MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲亞砜(DMSO)以充分溶解沉淀，于490 nm下測定吸光度值(A)。

1.2.3 Hyp含量影響的測定 將處于對(duì)數(shù)生長期的HSF以5×107/L細(xì)胞密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁后，換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h以同步化細(xì)胞生長，然后換用含不同濃度槲皮素的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以正常無血清RPMI-1640培養(yǎng)液作為對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。收集培養(yǎng)上清液按Hyp測定試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.4 HSF周期檢測 將1.2.3收集上清液后的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，70%冷乙醇固定、PI染色后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。計(jì)算增殖指數(shù)(PI)，即處于增殖期(包括S期及G2期)的細(xì)胞所占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。

Hyp含量(μg/ml)=(測定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5 μg/ml)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.5 Col I及HA含量測定 取1.2.3中收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定Col Ⅰ及HA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對(duì)HSF增殖能力的影響 槲皮素作用HSF 24 h，附著槲皮素劑量的增加，其刺激HSF增殖作用逐漸增加，與對(duì)照組(0.522±0.026)比較，槲皮素低、中、高劑量細(xì)胞A值(0.624±0.051，0.944±0.054，1.074±0.082)均明顯增加(P<0.05)；槲皮素各劑量組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 槲皮素對(duì)HSF細(xì)胞周期的影響 隨著槲皮素作用濃度的增加，處于增殖期的細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，不同濃度槲皮素組PI均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，與槲皮素低劑量組比較，槲皮素高劑量組HSF PI明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 槲皮素對(duì)HSF細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與槲皮素低劑量組比較：2)P<0.05

2.3 槲皮素對(duì)HSF培養(yǎng)上清Hyp、ColⅠ、HA含量影響 不同濃度槲皮素作用于HSF 24 h后，培養(yǎng)上清中Hyp、ColⅠ、HA含量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，槲皮素各處理組之間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，各濃度槲皮素組Hyp、ColⅠ、HA含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈現(xiàn)出了明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，見表2。

表2 槲皮素對(duì)HSF培養(yǎng)上清Hyp、ColⅠ、 HA含量的影響

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與槲皮素低劑量組比較:2)P<0.05；與槲皮素中劑量組比較:3)P<0.05

3 討 論

皮膚真皮層主要細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，皮膚老化主要表現(xiàn)為HSF增殖能力下降，數(shù)量減少，抗酶破壞力降低，合成和分泌膠原纖維的數(shù)量和質(zhì)量也逐漸減少，導(dǎo)致真皮厚度變薄，彈性變差，以致出現(xiàn)皮膚出現(xiàn)松弛與褶皺〔3〕。本研究結(jié)果表明槲皮素可刺激HSF增生，從而起到延緩衰老作用。

HSF主要功能之一是合成和分泌ColⅠ和ColⅢ，后者是皮膚光滑、柔嫩、彈性程度的主要決定因素〔4〕。Hyp是膠原纖維與膠原蛋白中的一種主要而又相對(duì)恒定的氨基酸，常用來評(píng)價(jià)組織中總膠原含量。研究發(fā)現(xiàn)，老年人的Hyp比年輕人要少〔5〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素可刺激HSF分泌Col Ⅰ，表明槲皮素可能對(duì)維持皮膚彈性、減少皮膚皺紋有一定作用。

HA是一種酸性黏多糖，參與潤滑關(guān)節(jié)、調(diào)節(jié)血管壁的通透性、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等。對(duì)于皮膚，HA由HSF產(chǎn)生，是一種多功能基質(zhì)，具有特殊的保水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質(zhì)，被稱為理想的天然保濕因子(NMF)。同時(shí)HA還可以改善皮膚營養(yǎng)代謝，使皮膚柔嫩、光滑、去皺、增加彈性、防止衰老，在保濕的同時(shí)又是良好的透皮吸收促進(jìn)劑。正常情況下，皮膚組織中含有大量的HA，隨著年齡不斷增長，HA的含量不斷減少，活性也隨之降低。本研究表明槲皮素可能對(duì)維持機(jī)體HA的正常水平、延緩衰老有重要意義。

1 Chung JH，Seo JY，Choi HR，etal.Modulation of skin collagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo〔J〕.J Invest Dermatol，2001；117(5)：1218-24.

2 趙 娟，石 艷，孫 波，等.人皮膚成纖維細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008；34(5)：899-902.

3 Rohrer TE.Soft tissue filler substances〔J〕.Curr Prob Dermatol，2001；13(4)：7-10.

4 李曉格，李世榮，曹 川.強(qiáng)脈沖光對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞膠原合成的影響及其機(jī)制探討〔J〕.中國美容醫(yī)學(xué)雜志，2010；19(11)：1643-5.

5 蘆 源，張 鷗.皮膚老化及其防治研究進(jìn)展〔J〕.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001；7(8)：69-71.

〔2016-12-20修回〕

(編輯 滕欣航)

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助(2015-515)

田亞萍(1973-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事皮膚衰老研究。

詹雪芬(1968-)，女，主管護(hù)師，主要從事衰老機(jī)制研究。

R28

A

1005-9202(2017)08-1845-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.010

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科

2 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)系