5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)百草枯誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的影響

王 煒 侯 艷 石恩林 李重陽

(甘肅政法學(xué)院公安技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)百草枯誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的影響

王 煒1侯 艷2石恩林 李重陽1

(甘肅政法學(xué)院公安技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

目的 探討甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5′-aza-dC)對(duì)百草枯所誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的影響。方法 SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)先用5′-aza-dC處理24 h，然后暴露于百草枯12 h。對(duì)細(xì)胞凋亡比例、相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)以及培養(yǎng)液上清中活性氧簇(ROS)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 和百草枯加5′-aza-dC干預(yù)后SH-SY5Y細(xì)胞活性顯著降低，凋亡增加。此外，與單獨(dú)百草枯處理相比，在暴露于百草枯加5′-aza-dC的聯(lián)合作用后，ROS水平顯著增加(P<0.05)。抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax表達(dá)增加，Bcl-2/Bax的比例下降，同時(shí)，細(xì)胞色素C的表達(dá)增加。結(jié)論 5′-aza-dC通過干預(yù)調(diào)節(jié)DNA甲基化，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激增加，并啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，這些進(jìn)一步加重百草枯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)毒作用。

5-氮雜-2-脫氧胞苷；百草枯；帕金森病；凋亡；氧化應(yīng)激

環(huán)境因素長(zhǎng)久以來一直被認(rèn)為可能參與帕金森病(PD)的發(fā)病，這是由于神經(jīng)毒素優(yōu)先破壞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多巴胺黑質(zhì)紋狀體通路。職業(yè)性接觸農(nóng)藥和持續(xù)暴露于除草劑如百草枯可以增加患PD的風(fēng)險(xiǎn)〔1，2〕。但是，目前尚無單一環(huán)境中有害物質(zhì)可引起PD的報(bào)道，說明其他風(fēng)險(xiǎn)因素必然參與散發(fā)性PD的發(fā)展。盡管PD也有遺傳因素影響，導(dǎo)致部分人群存在PD易感性〔3〕。然而環(huán)境中一些潛在的可疑化合物對(duì)細(xì)胞的功能和代謝存在長(zhǎng)期影響，這些化合物的長(zhǎng)期暴露可以導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)的改變，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)，由于表觀遺傳學(xué)主要影響基因表達(dá)而對(duì)DNA序列基本無影響，因此是屬于動(dòng)態(tài)可變的調(diào)節(jié)因素，已經(jīng)有不少的研究顯示，基因啟動(dòng)子的甲基化水平不僅反映人衰老的程度，并可以促進(jìn)衰老〔4〕。一些神經(jīng)元保護(hù)性基因啟動(dòng)子區(qū)域的異常高甲基化，可以引起相關(guān)功能基因表達(dá)下調(diào)，因此，長(zhǎng)期暴露在有毒化合物質(zhì)中的人體是否會(huì)引起DNA甲基化的異常修飾，進(jìn)而引起散發(fā)多巴胺能神經(jīng)元退行性病變的發(fā)生亟待大量實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證和認(rèn)知。本研究探討百草枯暴露以及5-氮雜-2-脫氧胞苷(5'-aza-dC)干預(yù)后對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性的影響。為深入探索PD的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM，胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Life公司，Annexin V-FITC/propidium凋亡檢測(cè)試劑盒以及N′-硝基-L-精氨酸(NO合酶抑制劑)購(gòu)自羅氏公司。5，6-羧基-2′，7′-二氯熒光黃-二乙酸酯(DCFH-DA，活性氧檢測(cè)探針)，四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)，5′-aza-dC和百草枯購(gòu)自Sigma公司。大鼠抗人Bcl-2，Bax和細(xì)胞色素C的抗體購(gòu)自Santa Cruz。兔抗GAPDH抗體自Abcam 公司。辣根過氧化物酶耦聯(lián)的山羊抗兔IgG以及化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)系統(tǒng)(ECL檢測(cè)試劑)均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)以及藥物處理 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SH-SY5Y細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)液中(含有10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 IU/ml青-鏈霉素)，環(huán)境為37℃含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。百草枯于DMSO中制備成10 mmol/L的儲(chǔ)液(使用時(shí)培養(yǎng)液稀釋)，5′-aza-dC溶解于的磷酸鹽緩沖鹽中，制成0.5 mmol/L的儲(chǔ)液。處理時(shí)，這些細(xì)胞被隨機(jī)分為四組：對(duì)照組，5′-aza-dC干預(yù)組，百草枯組和5′-aza-dC +百草枯組。5′-aza-dC +百草枯組預(yù)先用5′-aza-dC干預(yù)24 h，然后暴露于百草枯12 h。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 使用MTT比色法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生存率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)前1 d細(xì)胞按1×104/孔鋪96孔板，按指定時(shí)間用化合物處理后，加入5 mg/ml MTT溶液，37℃孵育4 h后在酶標(biāo)儀上570 nm處讀數(shù)。以對(duì)照組OD570 nm為空白對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞分別用5′-aza-dC，百草枯組和5′-aza-dC+百草枯處理24 h，并設(shè)置對(duì)照組。胰酶消化為單細(xì)胞懸液后，PBS漂洗2次，按照試劑盒說明書，加入含Annexin-V和碘化丙啶的試劑，暗處避光常溫孵育10～15 min，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，并分析凋亡細(xì)胞比例。

1.5 活性氧簇(ROS)檢測(cè) 暴露于5′-aza-dC或百草枯或5′-aza-dC+百草枯12 h后，使用氧化敏感熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，細(xì)胞胰酶消化后處理成單細(xì)胞懸液。用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA儲(chǔ)液，使終濃度為10 μmol/L，37℃孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞2次，在488 nm激發(fā)，525 nm波長(zhǎng)檢測(cè)熒光水平。

1.6 免疫印跡 細(xì)胞取出后棄上清，冷PBS淋洗細(xì)胞2遍，RIPA裂解液中冰上裂解細(xì)胞5 min，離心后收集蛋白上清在10%的SDS-page膠上電泳。蛋白分離后經(jīng)恒流1.5 h電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，使用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h，與Bcl-2以及Bax等特異性抗體4℃孵育過夜后，次日加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL發(fā)光液，暗室中壓片顯影。NIH Image J(Version 1.48)軟件對(duì)樣品中各個(gè)條帶的灰度值進(jìn)行計(jì)算，并用β-actin的灰度值進(jìn)行均一化處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 5′-aza-dC干預(yù)促進(jìn)百草枯對(duì)細(xì)胞活力的影響 MTT法研究顯示，當(dāng)單獨(dú)使用百草枯處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SH-SY5Y 24 h后，當(dāng)百草枯濃度≤80 μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響，當(dāng)濃度>80 μmol/L時(shí)，隨著劑量的增加對(duì)細(xì)胞的抑制增殖作用逐漸遞增，320 μmol/L時(shí)，抑制率達(dá)到(60±8)%。5′-aza-dC在0.5 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響。因此，后續(xù)時(shí)使用80 μmol/L和5′-aza-dC聯(lián)合作用。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞用5′-aza-dC(0.5 μmol/L)作用24 h，然后暴露在百草枯(80 μmol/L)12 h，存活率明顯低于僅暴露于5′-aza-dC干預(yù)或百草枯中12 h。見表1。

2.2 5′-aza-dC +百草枯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 通過Annexin V/PI雙染結(jié)果表明，暴露于5′-aza-dC(0.5 μmol/L)或百草枯(80 μmol/L)不會(huì)導(dǎo)致顯著細(xì)胞凋亡或壞死。然而，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理以5′-aza-dC(0.5 μmol/L)處理24 h，然后暴露百草枯(100 μmol/L)12 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡比例(44.4±3.2)%是顯著大于細(xì)胞暴露于5′-aza-dC干預(yù)或百草枯單獨(dú)干預(yù)組，見表1。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組處理后SH-SY5Y細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.3 5′-aza-dC+百草枯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性氧的影響 SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)過不同組處理后，流式細(xì)胞儀顯示，在對(duì)照組中平均DCFH-DA熒光強(qiáng)度為(550±40)。在5′-aza-dC干預(yù)(0.5 μmol/L)和百草枯(80 μmol/L)組，DCF平均熒光強(qiáng)度分別為(520±33)和(620±29)。ROS水平與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。而5′-aza-dC+百草枯組中，平均的DCF熒光強(qiáng)度為(888±45)，提示ROS水平顯著高于對(duì)照組及單用5′-aza-dC或百草枯干預(yù)組，表明5′-aza-dC處理后，細(xì)胞對(duì)百草枯的氧化應(yīng)激水平提高，這可能與細(xì)胞的凋亡增加密切相關(guān)。

2.4 SH-SY5Y細(xì)胞中凋亡線粒體途徑中相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，Bax蛋白和細(xì)胞色素C的水平在聯(lián)合處理組中水平要高于單獨(dú)處理的水平。而Bcl-2蛋白的表達(dá)則相反，在聯(lián)合組中要低于單獨(dú)處理組，通過對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行光密度分析、定量和均一化(與內(nèi)參GAPDH比較)后發(fā)現(xiàn)(圖1)，聯(lián)合組中Bax和細(xì)胞色素C的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bax和細(xì)胞色素C的體現(xiàn)在5′-aza-dC干預(yù)或百草枯單獨(dú)組沒有變化。然而5′-aza-dC+百草枯組中，表達(dá)Bcl-2降低，Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2/Bax的速度下降，因而細(xì)胞色素C表達(dá)增加。見表1。

1～4：對(duì)照組、5-aza-dC組、百草枯組、5′-aza-dC+百草枯組圖1 5′-aza-dC及百草枯處理SY-SH5Y細(xì)胞后 對(duì)線粒體凋亡途徑中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

暴露于環(huán)境毒素和遺傳修飾被認(rèn)為可能參與PD發(fā)病中〔5〕。本研究的結(jié)果顯示，在正常對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響的濃度下，當(dāng)百草枯和甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5′-aza-dC聯(lián)合作用后，可以引起細(xì)胞增殖的抑制，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有比較大的損傷，這也說明DNA甲基化程度的削弱，可能導(dǎo)致PD發(fā)生的門檻降低，從而提高PD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

百草枯作為常用用于控制雜草生長(zhǎng)的除草劑，過去的國(guó)內(nèi)外研究顯示，百草枯不僅可以嚴(yán)重?fù)p傷多巴胺能神經(jīng)元，而且與PD風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)〔6，7〕。本研究結(jié)果也證實(shí)，當(dāng)百草枯的濃度大于80 μmol/L時(shí)候，抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)顯著增加，而低濃度的百草枯對(duì)細(xì)胞增殖的影響不顯著，一般情況下，就算長(zhǎng)期接觸百草枯，體內(nèi)血液中的濃度很少會(huì)達(dá)到這個(gè)水平。說明百草枯若要對(duì)人體神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮顯著影響，存在某個(gè)特定條件。5′-aza-dC作為常用的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以引起基因組DNA全局化的甲基化抑制，從而使得不少基因上游啟動(dòng)子的甲基化水平降低，某些基因表達(dá)增加〔8〕。本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)5′-aza-dC預(yù)先處理后，可以顯著提高百草枯對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性，抑制其增殖。進(jìn)一步通過凋亡分析顯示，5′-aza-dC+百草枯后細(xì)胞凋亡也增加。PD的神經(jīng)變性過程往往伴隨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的提高〔9〕。本文結(jié)果顯示，通過削弱基因組的甲基化程度，使得環(huán)境毒物百草枯對(duì)細(xì)胞的毒性增加，其作用可能是通過提高ROS水平，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡而引起，推及到體內(nèi)，以前的研究表明，隨著人體老化的發(fā)生，一些神經(jīng)元的保護(hù)基因的功能可以因表遺傳學(xué)改變而受損〔10〕，環(huán)境毒物及重金屬等的暴露也可以改變基因表達(dá)，以上二者交互作用后引起遲發(fā)性的神經(jīng)退行性疾病發(fā)生。

有充分的證據(jù)顯示，線粒體凋亡信號(hào)途徑在PD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用〔11〕。DNA甲基化也已牽涉許多宿主細(xì)胞的很多信號(hào)通路，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)〔12，13〕，包括線粒體凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Bcl-2蛋白家族通過調(diào)控線粒體功能中起著凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。Bax和Bcl-2是主要的凋亡蛋白，并分別作為凋亡誘導(dǎo)劑和抑制劑，Bax蛋白也被證明在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡響應(yīng)于應(yīng)激刺激發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Bax蛋白的很大一部分是位于正常細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在氧化應(yīng)激壓力下，Bax蛋白重新分布到線粒體，易位到線粒體后，Bax蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，外線粒體細(xì)胞膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，這也是誘導(dǎo)caspase-3活化的充分條件，是神經(jīng)細(xì)胞凋亡內(nèi)源性途徑的標(biāo)志性事件〔14〕。很少有研究著重對(duì)在百草枯所誘發(fā)線粒體凋亡信號(hào)通路進(jìn)行研究，我們的研究表明，5′-aza-dC+百草枯暴露后抗凋亡關(guān)鍵蛋白(Bcl-2蛋白)的表達(dá)顯著下降，增加Bax蛋白的表達(dá)，并刺激了細(xì)胞色素C從線粒體釋放，從而最終促進(jìn)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，DNA甲基化修飾減少，使得PD發(fā)生的門檻降低，類似百草枯這樣的環(huán)境毒物可以對(duì)細(xì)胞的損傷增加，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，并使得多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平增加，并可以引起線粒體途徑的活化，啟動(dòng)凋亡內(nèi)源性途徑，總的效果是引起神經(jīng)元細(xì)胞的損傷和死亡，這些或許可以用于解釋長(zhǎng)期暴露百草枯類除草劑后，可以誘導(dǎo)老年人發(fā)生PD。后續(xù)的研究將著重探討體內(nèi)模型中，在暴露百草枯及影響甲基化水平后對(duì)PD發(fā)生和進(jìn)展的影響。

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〔2015-02-23修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

國(guó)家社科基金青年項(xiàng)目(No.15CGL064)；甘肅政法學(xué)院科研青年項(xiàng)目(No.GZF2d3XQNLW015)

王 煒(1982-)，男，理學(xué)碩士，講師，主要從事藥理學(xué)、毒理學(xué)及毒物分析等相關(guān)領(lǐng)域研究。

R992

A

1005-9202(2017)08-1878-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.024

1 甘肅政法學(xué)院甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2 中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院呼吸內(nèi)科