多奈哌齊與左卡尼汀治療癡呆模型大鼠的療效比較

申東方 田曉彥 宋榮蓉

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科，黑龍江 哈爾濱 150001)

多奈哌齊與左卡尼汀治療癡呆模型大鼠的療效比較

申東方 田曉彥1宋榮蓉

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的 比較左卡尼汀和多奈哌齊對腦室注射鏈脲佐菌素(STZ)致癡呆大鼠的治療作用。方法 健康SD雄性大鼠32只，隨機分為對照組、模型組、左卡尼汀組、多奈哌齊組(n=8)。模型組和治療組在手術的第1、3天分別向兩側側腦室內注射STZ 3 mg/kg，對照組給予相同體積的檸檬酸緩沖液。左卡尼汀組于手術10 d前給予左卡尼汀20 mg·kg-1·d-1灌胃，術后持續90 d，多奈哌齊組給予多奈哌齊0.45 mg·kg-1·d-1灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水。術后第10、90天Morris水迷宮試驗，觀察大鼠學習記憶能力。術后8 w處死大鼠取海馬送電鏡觀察神經元凋亡情況。結果 術后10 d水迷宮測試，與對照組比較，模型組、左卡尼汀組、多奈哌齊組的潛伏期延長，過平臺次數下降(P<0.01)。術后治療90 d，與模型組比較，多奈哌齊組的潛伏期縮短，過平臺次數增加(P<0.01)，左卡尼汀組潛伏期縮短(P<0.05)，過平臺次數無明顯增加(P>0.05)。左卡尼汀組與多奈哌齊組比較各指標差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，兩治療組電鏡下觀察大鼠海馬細胞結構細胞凋亡程度輕，以多奈哌齊治療組明顯。結論 左卡尼汀與多奈哌齊都能減輕AD模型鼠海馬神經元的凋亡，從而起到改善臨床癥狀的作用，左卡尼汀效果不如多奈哌齊。

阿爾茨海默病；左卡尼汀；多奈哌齊；神經元凋亡

預計2050年以后，全球的阿爾茨海默病(AD)患病率將是目前的4倍〔1〕，但其病因迄今不明。抗膽堿酯酶藥物是美國食品與藥品管理局(FDA)最先批準使用治療本病的藥物，多奈哌齊用于治療AD病人，已被證明有效，但只能使患者的認知水平下降減輕，卻并不能減慢疾病的變性進程。本實驗比較左卡尼汀與多奈哌齊對AD大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD雄性大鼠32只，2.5～3個月齡，體重200～250 g。由北京通利華實驗動物技術有限公司提供。大鼠隨機分為對照組、模型組、多奈哌齊組、左卡尼汀組，每組8只。

1.2 主要試劑及儀器設備 左卡尼汀(東北制藥總廠)，多奈哌齊(法國PFIZEK·PGM公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，枸櫞酸鈉溶液(武漢博士德生物工程有限公司)，10%水合氯醛，大鼠立體定位儀(江西醫療器械研究所)，Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所)。

1.3 模型制作方法

1.3.1 動物的篩選與分組 在實驗前先將大鼠進行水迷宮初篩，測量大鼠對水迷宮學習與記憶的獲取能力。通過初篩，去除先天癡呆(潛伏期平均值>50 s)和游泳姿勢不良者，將合格大鼠32只隨機分為對照組，模型組和多奈哌齊組、左卡尼汀組，每組各8只。

1.3.2 動物模型的制作 水迷宮測試48 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，參考包新民《大鼠腦立體定向圖譜》〔2〕，將大鼠的頭固定于立體定位儀上，剪去局部毛發，消毒后沿矢狀線切開皮膚，切口長約1.5 cm，將骨膜向兩側推開暴露顱骨，在前囟后1.5 mm、矢狀縫側方1.5 mm處鉆孔，微量進樣器垂直進入，深度距離腦表面3.5 mm，將STZ溶于檸檬酸緩沖液中(pH4.4)，緩慢注入模型組、多奈哌齊組、左卡尼汀組大鼠。在手術的第1、3天分別向兩側側腦室內注射，每次每側注入約10 μl(3 mg/kg)。對照組大鼠腦室內注射相同體積的檸檬酸緩沖液。每側注入時間為5 min，留針5 min，緩慢出針。無菌骨蠟封閉鉆孔，術區滴慶大霉素，縫合消毒。術后大鼠除給予普通飼料及自來水喂養外，牛奶灌胃4 d，青霉素肌注(1次/d，注射5 d)以防止感染。

1.3.3 各組大鼠的處置 多奈哌齊組：大鼠于手術前給予多奈哌齊0.45 mg·kg-1·d-1灌胃10 d，于側腦室注射STZ術后再持續多奈哌齊灌胃治療90 d。左卡尼汀組：大鼠于手術前給予左卡尼汀20 mg·kg-1·d-1灌胃10 d，于側腦室注射STZ術后再持續左卡尼汀灌胃治療90 d。模型組：大鼠于手術前給予與治療組等量生理鹽水灌胃10 d。于側腦室注射STZ后再持續生理鹽水灌胃持續90 d。對照組：大鼠于手術前給予與治療組等量生理鹽水灌胃10 d。于側腦室注射與治療組等量檸檬酸平衡液術后再持續生理鹽水灌胃90 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠學習記憶能力觀察 分別于術后第10、90天進行水迷宮試驗，觀察大鼠學習記憶能力。

1.4.2 電鏡觀察 術后90 d處死大鼠取腦海馬部位，HE染色及送電鏡觀察神經元凋亡情況。HE染色：將石蠟切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，二甲苯(Ⅰ)15 min→二甲苯(Ⅱ)15 min→二甲苯(Ⅲ)15 min→100%乙醇10 min→100%乙醇10 min→95%乙醇10 min→90%乙醇10 min→75%乙醇10 min→蒸餾水沖洗兩遍→蘇木素染色10～15 min→伊紅復染→透明、干燥→中性樹膠封片。送電鏡觀察神經元凋亡情況。電鏡用固定液(本校電鏡室提供)固定過夜，PBS漂洗，丙酮脫水，1%四氧鋨酸后固定，環氧樹脂包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察。PBS漂洗2次，2.5%的戊二醛固定后送哈爾濱醫科大學電鏡室觀察。

1.5 統計學方法 采用SPSS統計軟件包進行t檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠學習記憶能力的變化 術前對照組、模型組、左卡尼汀組、多奈哌齊組的潛伏期及過平臺次數無顯著差異(P>0.05)。術后第10天，而模型組、左卡尼汀組、多奈哌齊組潛伏期較對照組明顯延長(P<0.01)，過平臺次數明顯減少(P<0.01)。表明STZ側腦室注射10 d后大鼠認知功能明顯下降。術后給予藥物治療90 d，多奈哌齊組、左卡尼汀組與模型組潛伏期差異顯著(P<0.01,P<0.05)；左卡尼汀組與多奈哌齊組比較差異顯著(P<0.05)，表明多奈哌齊及左卡尼汀組均減短潛伏期，多奈哌齊組更明顯。多奈哌齊組過平臺次數與模型組差異顯著(P<0.01)；左卡尼汀組與模型組無統計學差異(P>0.05)，表明多奈哌齊組增加過平臺次數，左卡尼汀組則不明顯，表明多奈哌齊治療改善大鼠認知功能，而左卡尼汀的治療作用則不如多奈哌齊。見表1，表2。

表1 不同時期大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與多奈哌齊組比較：4)P<0.05，下表同

表2 大鼠過平臺次數,次)

2.2 組織學改變 ①HE染色：對照組大鼠海馬形態完整，神經元數量多，細胞排列整齊，胞內結構正常，染色正常。術后模型組大鼠海馬結構異常，神經元細胞明顯減少，錐體細胞帶紊亂、變稀、中斷，可見許多細胞體積縮小，胞核固縮，出現較多凋亡細胞。多奈哌齊、左卡尼汀組較模型組細胞數增多，細胞結構較完整，其中，多奈哌齊組優于左卡尼汀組,見圖1。②電鏡下細胞學結果：模型組海馬細胞皺縮，表面微絨毛消失，線粒體空泡變，核周板層體崩解成髓樣變，其他細胞器消失。而多奈哌齊組細胞表面微絨毛較豐富，細胞器結構和膜結構較完整。左卡尼汀組細胞表面絨毛可見，核周體及線粒體明顯減少，見圖2。

圖1 各組海馬細胞HE染色(×400)

圖2 各組海馬細胞學改變(×11 500)

3 討 論

AD是老年人常見的神經系統變性病，主要表現為持續進行性認知功能障礙而無緩解，其病理特征為老年斑、神經元纖維纏結、海馬錐體細胞空泡變性及神經元缺失。隨著神經元的缺失，各種神經遞質也隨之缺乏，其中最早也最明顯的是乙酰膽堿。膽堿能受體除與大腦的學習和記憶功能有關外，還與神經保護作用有關〔3〕。這也是目前AD治療獲得有限療效的重要基礎。

多奈哌齊是一種具有高度選擇性、可逆性的膽堿酯酶抑制劑，通過抑制膽堿酯酶而抑制乙酰膽堿降解并提高活性，改善神經遞質的傳遞功能。左卡尼汀是哺乳動物能量代謝中需要的內源性物質，在機體能量代謝中必不可少，可促進脂類、葡萄糖以及氨基酸的代謝而改善機體能量供應，其中以促進脂肪的氧化代謝作用最為突出〔4，5〕。左卡尼汀與肌肉細胞、心肌細胞的能量代謝有關，對于各種組織缺血缺氧，左卡尼汀通過增加能量產生而提高組織器官的功能。左卡尼汀在治療心血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、糖尿病并發癥、突發性聾、慢性阻塞性肺疾病、減輕腫瘤化療藥物所致神經毒性和血液學毒性等方面取得了較好療效〔6～8〕。

小劑量STZ側腦室注射是目前國內外使用較多的制備癡呆動物模型的方法〔9，10〕。本實驗結果表明側腦室注射STZ制造大鼠癡呆模型可靠性好，穩定性高。多奈哌齊治療改善大鼠認知功能，左卡尼汀治療療效果不如多奈哌齊。

左卡尼汀對大鼠認知功能有一定的改善，我們認為這可能與左卡尼汀促進脂類、葡萄糖以及氨基酸的代謝而改善神經元的能量供應，通過增加能量產生而提高神經元細胞的功能，其次，左卡尼汀還是一種優良的抗氧化劑，可增加自由基清除酶活性而對抗氧化應激和炎癥反應，保護神經元細胞膜功能，從而對神經元到保護性作用。在本實驗中，左卡尼汀有一定的神經元保護作用，但不及多奈哌齊。本實驗樣本量小，下一步可進行大樣本的研究以驗證其作用。

1 吳 江.神經病學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2010：331.

2 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜(Ⅲ)〔M〕.北京：人民出版社，1991：12-8.

3 Dajas-Bailador F，Wonnacott S.Nicotinic acetylcholine receptors and the regulation of neuronal signaling〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2004；25：317-24.

4 Ramana KV.Aldose reductase：new insights for an old enzyme〔J〕.Biomol Concepts，2011；2(1-2)：103-14.

6 杜繼東.左卡尼汀的臨床應用現狀〔J〕.天津藥學，2013；25(3):548.

7 DiNicolantonio JJ，Lavie CJ，Fares H，etal.L-carnitine in the secondary prevention of cardiovascular disease：systematic review and meta-analysis〔J〕.Mayo Clin Proc，2013；88(6)：544-51.

8 Vidal-Casariego A，Burgos-Peláez R，Martínez-Faedo C.Metabolic effects of L-carnitine on type 2 diabetes mellitus：systematic review and meta-analysis〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes,2013；121(4)：234-8.

9 Nataniel Lester-Coll，Enrique J Rivera.Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes：relevance to sporadic Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimer Dis，2006;9(1)：13-33.

10 Lannert H,Hoyer S.Intracerebroventricular administration of streptozotocin causes long-term diminutions in learning and memory abilities and in cerebral energy metabolism in adult rats〔J〕.Behav Neurosci,1998;112(5):1199-208.

〔2015-12-20修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

黑龍江省自然基金資助項目(No.0200869)

宋榮蓉(1965-)，女，博士，主任醫師，主要從事阿爾茨海默病、帕金森病的研究。

申東方(1984-)，女，博士在讀，主治醫師，主要從事阿爾茨海默病、帕金森病的研究。

R749

A

1005-9202(2017)08-1888-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.028

1 哈爾濱醫科大學附屬第四醫院老年病科