中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白和基質金屬蛋白酶-9與肺腺癌預后的關系

張乃丹 袁成良 劉利洪 曾傳蓉

(德陽市人民醫院檢驗科，四川 德陽 618000)

·腫 瘤·

中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白和基質金屬蛋白酶-9與肺腺癌預后的關系

張乃丹 袁成良 劉利洪 曾傳蓉

(德陽市人民醫院檢驗科，四川 德陽 618000)

目的 探討中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)和基質金屬蛋白酶(MMP)-9與肺腺癌患者預后的關系。方法 收治50例肺腺癌患者，免疫組化檢測患者腫瘤組織中NGAL和MMP-9的表達，分析NGAL、MMP-9與臨床預后的關系以及二者的相關性。結果 肺腺癌患者腫瘤組織中NGAL平均表達量為70%，MMP-9為30%。單因素分析顯示NGAL水平、腫瘤分期均與患者總生存期(OS)相關。NGAL表達水平<70%的患者OS中位數是45.7個月(95%CI15.2～76.2個月)；NGAL表達水平≥70%的患者OS中位數是4.6個月(95%CI0.5～18.8個月；P<0.000 1)。Ⅲ期腫瘤患者 OS中位數是15.57個月(95%CI9.8～21.2)個月，Ⅳ期是9.6個月(95%CI0.8～18.4個月；P=0.002)。NGAL與MMP-9呈低度相關。MMP-9表達水平與OS差異無統計學意義(P>0.05)。結論 腫瘤組織中NGAL表達≥70%提示預后較差，MMP-9表達水平與預后無明顯相關。

脂質運載蛋白；惡性腺癌；金屬基質蛋白-9

中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)參與了細胞凋亡〔1，2〕、分化、驗證免疫應答〔3〕、脂質代謝和腫瘤發生發展的多個過程〔4，5〕。基質金屬蛋白酶(MMP)-9通過降解基底膜和細胞外機制參與了惡性腫瘤細胞的血管生成、侵襲和轉移〔6〕。有研究顯示〔7〕NGAL對MMP-9有正調控作用。有研究表明，在乳腺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌和直腸癌組織中NGAL表達提示較差的預后，而在卵巢癌組織中NGAL表達提示較好的預后〔8，9〕。本研究旨在探討NGAL與MMP-9在肺腺癌患者預后判斷中的意義，分析NGAL和MMP-9在肺腺癌中的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 德陽市人民醫院2012年1月至2016年1月收治的50例肺腺癌患者，排除組織病理為非腺癌的肺癌患者以及曾接受化療和放療者。其中男27例，女23例，年齡(61.4±7.1)歲，中位年齡61歲。38例有吸煙史。患者在診斷為肺腺癌時的腫瘤分期Ⅰ期9例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期23例。Ⅱ～Ⅳ期的患者均接受鉑類細胞毒性化療治療(輔助或姑息)。患者隨訪(25.6±32.2)個月。所有患者肺癌組織經手術切除后立即置于液氮中保存備用，其余部分用10%多聚甲醛固定后送病理科做組織化學檢測。治療方案都遵循國際肺癌治療原則〔3〕。

1.2 免疫組化檢測 免疫組化采用標準的抗生素蛋白標記過氧化物酶法，樣本組織先經石蠟包埋后切成4 μm厚切片，組織切片經脫蠟處理后置于3% H2O2內滅活內源性過氧化物酶，經檸檬酸抗原修復液修復后自然冷卻，NGAL抗體按1∶100稀釋(〔NGAL，GTX63306〕 Clone：EPR5084，品牌：GeneTex?)；MMP-9抗體按1∶200稀釋〔MMP-9-GTX100458〕 Clone：NCl，品牌：GeneTex?Dilution 1∶200)，滴加一抗后4℃冰箱過夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3 min/次，后滴加聚合物輔助劑，室溫孵育30 min后再用PBS沖洗3次，2 min/次；滴加辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫下孵育30 min；PBS沖洗3次，2 min/次，滴加DAB顯色10～15 min，PBS沖洗干凈終止反應。蘇木精復染3 min，乙醇梯度脫水，放入透明二甲苯中10 s，中性樹脂封片。

1.3 結果判定標準 所有切片均由本院1位經驗豐富的病理科醫生雙盲觀察。作為NGAL陽性參照的是子宮頸內膜腺細胞細胞質中強陽性染色片，作為MMP-9陽性參照的是肺泡巨噬細胞細胞質中強陽性染色片，陰性對照采用的一抗滴加PBS的切片。NGAL和MMP-9的表達以胞質中的棕黃色染色為陽性。根據棕黃色著色深淺以及陽性細胞數占腫瘤細胞總數的百分比計分，采用0～計分法(0，陰性；+弱陽性；強陽性)。

1.4 預后結果分析 無進展生存期(PFS)是指從隨機化到病人出現腫瘤進展或死亡的時間，總生存期(OS)是指從隨機化開始至因任何原因引起死亡的時間。NGAL、MMP-9表達與患者PFS關系的數據以表格形式列出；NGAL、MMP-9表達與OS關系以生存曲線形式表示。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行q檢驗、Dunettt-t檢驗和χ2檢驗。

2 結 果

2.1 NGAL和MMP-9蛋白表達 50例患者中，48例有NGAL蛋白表達，38例有MMP-9蛋白表達，見圖1。NGAL表達陰性者組織中，MMP-9的表達也為陰性。大部分患者腫瘤組織中NGAL表達強度為(39例，78%)，MMP-9表達強度為(19例，38%)。患者腫瘤組織中平均NGAL和MMP-9表達百分比為70%和30%。NGAL表達<70%(n=11)患者，MMP-9表達的均值為(22.3±27)%；NGAL表達≥70 %(n=38)患者，MMP-9表達的均值為(52.1±39)%。相關分析結果顯示，肺腺癌患者腫瘤組織中NGAL和MMP-9表達水平呈較弱相關性(P=0.007，r=0.48)，見圖2。

圖1 肺腺癌患者腫瘤組織NGAL、MMP-9蛋白表達(×400)

圖2 腫瘤組織中NGAL與MMP-9蛋白相關性分析

2.2 NGAL、MMP-9表達與PFS 未得到Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者PFS的相關數據。Ⅲ～Ⅳ期患者PFS中位數為10.8個月(95%CI5.9～15.7個月)。NGAL表達<70%提示具有較好PFS；NGAL表達≥70%提示PFS較差。MMP-9表達與PFS無明顯相關，見表1。

2.3 NGAL、MMP-9表達與OS 50例肺腺癌患者OS中位數是17個月(95%CI：4.7～29.2個月)。單因素分析顯示，患者肺癌確診時的分期和NGAL表達水平是影響OS的直接因素。Ⅰ～Ⅱ期肺癌患者OS的相關數據未獲得；Ⅲ期患者OS中位數15.57個月(95%CI：9.8～21.2個月)，Ⅳ期患者OS中位數9.6個月(95%CI：0.8～18.4個月，P=0.002)。NGAL表達<70%中位OS 45.7個月(95%CI：15.2～76.2個月)；NGAL表達≥70%中位OS 4.6個月(95%CI：0.5～18.8個月；P<0.000 1)。MMP-9表達<30%中位OS 36個月(95%CI：1.92～70.1個月)，MMP-9表達≥30%中位OS 15個月(95%CI：7.3～22.7個月)，兩組差異無統計學意義(P=0.568)。見圖3。

表1 肺腺癌患者PFS分析

圖3 NGAL、MMP-9蛋白表達與OS分析

3 討 論

目前國內外關于使用組織病理學指標判斷肺癌患者臨床預后的研究仍然存在諸多爭論，且目前的研究并沒有涉及腫瘤轉移患者的預后判斷〔10〕。本研究發現肺腺癌患者腫瘤組織中NGAL蛋白表達是肺腺癌獨立危險因素，可能作為判斷肺癌患者預后的新指標。

NGAL是載脂蛋白家族成員，該家族共有50多種成員，NGAL氨基酸序列和DNA內含子和外顯子的排列與其他成員有著高度保守性，因此NGAL具有結合和轉運疏水基團(如脂肪酸、前列腺素、花生四烯酸、類視黃醇類物質等)的功能，在免疫調節和維持細胞內環境穩態中具有重要意義〔5〕。NGAL通過將惡性腫瘤細胞外鐵離子轉運至胞質內，在腫瘤的增殖、分化和發展中具有促進作用〔11〕。有研究發現肝細胞生長因子、神經轉換因子、PMA、視黃酸、糖皮質激素等促進腫瘤細胞增殖的因子均具有促進NGAL合成和釋放的功能〔12〕。

NGAL是中性粒細胞來源的92 kD的MMP-9的共價鍵蛋白。通過形成NGAL/MMP-9二聚體，NGAL可以保護MMP-9不受蛋白酶的降解，從而MMP-9在細胞基質中表現出較強的明膠分解作用〔13〕。MMP-9的活性增強也是NGAL過表達時腫瘤侵襲和轉移的原因之一〔7〕。NGAL/MMP-9復合物在腫瘤組織高表達多提示膀胱癌、腦瘤、乳腺癌、食管癌、胃癌和惡性血液癌預較差〔13〕。

本研究結果提示患者臨床OS較差，且NGAL表達與預后的關系獨立于腫瘤分期，而且提示NGAL對肺腺癌患者OS的影響是獨立作用的并不依賴于MMP-9的交互作用。Zhang等〔14〕研究表明，在直腸癌中NGAL與MMP-9的表達提示直腸癌患者臨床預后較好，而本研究結果顯示NGAL表達提示肺腺癌患者臨床預后較差，對此認為NGAL在肺腺癌組織的調控作用主要依賴于鐵離子轉運機制，降低細胞間E鈣黏附素聚集，從而促進了新生癌細胞的侵襲與轉移〔15〕，用鐵離子螯合劑類藥物阻斷NGAL蛋白的表達可能成為治療肺腺癌的潛在靶點。已有研究證明在動物模型上通過減少鐵離子的儲存和包括NGAL在內的鐵離子運載體的表達，可以有效阻斷腫瘤細胞增殖〔16〕。

本研究結果表明，肺腺癌患者腫瘤組織中NGAL蛋白表達是獨立于腫瘤分期的，提示患者臨床預后的新指標，腫瘤組織中NGAL蛋白表達≥70%多提示患者預后較差。肺腺癌患者腫瘤組織中MMP-9蛋白表達與患者臨床預后以及與NGAL蛋白表達之間無明顯相關，提示NGAL在肺腺癌患者腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中具有獨立的分子機制。

1 Nguyen ET，Ackman JB，Rajiah P，etal.What′s new in 10 years?A revised cardiothoracic curriculum for diagnostic radiology residency with goals and objectives related to general competencies 〔J〕.Acad Radiol，2016；23(7)：911-8.

2 Saito M，Shiraishi K，Kunitoh H，etal.Gene aberrations for precision medicine against lung adenocarcinoma〔J〕.Cancer Sci，2016；107(6)：713-20.

3 Obeidat N，Awidi A，Ababneh N，etal.Frequency of epidermal growth factor receptor mutations in Jordanian lung adenocarcinoma patients at diagnosis〔J〕.J Cancer Res Ther，2016；12(2)：616-9.

4 Wenners AS，Mehta K，Loibl S，etal.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL) predicts response to neoadjuvant chemotherapy and clinical outcome in primary human breast cancer 〔J〕.PLoS One，2012；7(10)：e45826.

5 Marchewka Z，Tacik A，Piwowar A，etal.KIM-1 and NGAL as potential biomarkers for the diagnosis and cancer progression〔J〕.Postepy Hig Med Dosw，2016；18(70)：329-36.

6 Yu Y，Ding Z，Jian H，etal.Prognostic value of MMP9 activity level in resected stage IB lung adenocarcinoma 〔J〕.Cancer Med，2016；117(5)：703-10.

7 Candido S，Abrams SL，Steelman LS，etal.Roles of NGAL and MMP-9 in the tumor microenvironment and sensitivity to targeted therapy 〔J〕.Biochim Biophys Acta，2016；1863(3)：438-48.

8 Kaur S，Chakraborty S，Baine MJ，etal.Potential of plasma NGAL and MIC-1 as biomarker(s) in the diagnosis of lethal pancreatic cancer〔J〕.PLoS One,2013；8(2)：512-23.

9 Hogendorf P，Durczyski A，Skulimowski A，etal.Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin(NGAL) concentration in urine is superior to CA19-9 and Ca 125 in differentiation of pancreatic mass：preliminary report 〔J〕.BMC Veterinary Res,2016；16(4)：537-43.

10 Tan DS，Yom SS，Tsao MS，etal.The international association for the study of lung cancer consensus statement on optimizing management of EGFR mutation-positive non-small cell lung cancer：status in 2016〔J〕.J Thorac Oncol，2016；11(7)：946-63.

11 Liu MF，Hu YY，Jin T，etal.Matrix metalloproteinase-9/neutrophil gelatinase-associated lipocalin complex activity in human glioma samples predicts tumor presence and clinical prognosis〔J〕.Dis Markers，2015；13(7)：646-53.

12 Shinriki S，Jono H，Ueda M，etal.Stromal expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin correlates with poor differentiation and adverse prognosis in oral squamous cell carcinoma 〔J〕.Histopathology，2014；64(3)：356-64.

13 Candido S，Maestro R，Polesel J，etal.Roles of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in human cancer〔J〕.Oncotarget，2014；5(6)：1576-94.

14 Zhang XF，Zhang Y，Zhang XH，etal.Clinical significance of Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL) expression in primary rectal cancer〔J〕.BMC Cancer，2009；89(5)：531-48.

15 Hu L，Hittelman W，Lu T，etal.NGAL decreases E-cadherin-mediated cell-cell adhesion and increases cell motility and invasion through Rac1 in colon carcinoma cells 〔J〕.Lab Invest，2009；89(5)：531-48.

16 Gómez-Casado C，Roth-Walter F，Jensen-Jarolim E，etal.Modeling iron-catecholates binding to NGAL protein〔J〕.J Mol Graph Model，2013；9(45)：111-21.

〔2016-12-19修回〕

(編輯 李相軍)

張乃丹(1984-)，女，主管技師，主要從事臨床免疫學診斷研究。

R730.261

A

1005-9202(2017)08-1935-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.049