農用真菌抑菌劑對白及種子萌發及小苗生長分化的影響

趙雙雙，潘潔莉，劉 巧，蔣福升，陳 開，丁志山，李美芽*

(浙江中醫藥大學a.生命科學學院， b.分析測試中心，c.醫學技術學院，浙江 杭州 310053)

農用真菌抑菌劑對白及種子萌發及小苗生長分化的影響

趙雙雙a，潘潔莉b，劉 巧c，蔣福升a，陳 開a，丁志山c，李美芽b*

(浙江中醫藥大學a.生命科學學院， b.分析測試中心，c.醫學技術學院，浙江 杭州 310053)

測定農用真菌抑菌劑百菌清、多菌靈和代森錳鋅對白及組培中常見污染真菌的抑菌活性，同時探討這些抑菌劑對白及種子萌發和小苗分化生長的影響，以減少白及組培污染，提高組培效率。結果表明，3種抑菌劑對分離純化的6種白及常見污染真菌均具有較好的抑菌效果，其中多菌靈和代森錳鋅0.05%濃度可完全抑制真菌生長，但代森錳鋅對白及種子萌發和小苗生長毒性較大，不適宜作為組培添加劑；多菌靈0.05%以上濃度對白及小苗生長抑制較為明顯，但0.05%濃度對種子萌發影響較百菌清小；百菌清0.05%濃度對白及種子萌發影響相比多菌靈明顯，對小苗生長發育影響卻較小。進一步組培試驗表明，添加0.05%濃度的多菌靈可使白及種子母瓶污染率從30%降低至2%，抑菌效果明顯且不影響種子萌發。因此，0.05%多菌靈適合用于白及種子萌發，而0.05%百菌清適合用于后繼分化和生長育苗。

真菌抑菌劑； 白及； 萌發； 分化

中藥白及具有收斂止血，消腫生肌等功效[1]，長期以來主要靠采集野生資源供應市場需求，由于遭受破壞掠奪式采挖，目前野生資源匱乏，價格連年攀升，已超過800元·kg-1。為了解決這一藥用資源問題，課題組開展了白及組培快繁研究工作。前期研究發現，以白及果莢為材料進行組織培養，母瓶接種污染率有時高達30%以上，且多為真菌污染，這給組培生產帶來了極大浪費，也大大提高了生產成本。為了盡量降低組培成本，控制組培污染率提高生產效率是第一要務。一般企業要求污染率不高于5%，顯然，白及母瓶污染率非常之高，對產業化極為不利。因此，有必要采取合理措施，以有效降低污染率來提高生產效率。組培污染是相關生產企業面臨的共性問題，為此已有不少學者通過在培養基中添加不同抑菌劑，來探討其降低組培污染率提高生產效率的可行性[2-4]，并取得了較為滿意的效果。鑒于白及組培主要是真菌污染，因此，本研究選用代森錳鋅、多菌靈和百菌清這3種常用農用抑菌劑進行研究，探討其對白及常見污染真菌的抑制活性，同時分析其對白及種子萌發和小苗生長分化的影響，以便為后續產業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

超凈工作臺(上海比郎BL6-180A)，高壓滅菌鍋(日本Tomy)，電子天平(賽多利斯，BS110S)，恒溫培養箱(上海博迅，HPX-9082)，PDA培養基(杭州微生物試劑有限公司)，MS培養基(美國sigma公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 白及果莢消毒保存

白及果莢于2015年10月10日采自湖北省武穴市梅川鎮，經75%乙醇消毒5 min，0.1%升汞消毒20 min，然后35 ℃干燥至種子水分含量在5%～10%，4 ℃保存備用。

1.2.2 白及種子母瓶接種培養及污染情況分析

取上述已消毒干燥處理過的果莢，無菌操作接種于MS液體培養基中，每顆種子接種3瓶，共接種198瓶，于25 ℃，3 000 lx光照下培養，每天光照培養12 h，培養20 d后統計污染率。

1.2.3 白及母瓶培養常見污染真菌分離培養

收集1.2.2中污染真菌，接種于PDA培養基中，置于28 ℃，90%濕度恒溫培養箱中倒置培養，并采用菌絲頂端純化法[5]分離、純化各污染真菌。

1.2.4 農用抑菌劑對上述分離真菌抑制活性分析

向PDA培養基中加入不同濃度的農用抑菌劑(百菌清、多菌靈和代森錳鋅)，配成系列固體培養基。采用切塊法接種上述分離真菌，置于28 ℃，90%濕度恒溫培養箱中倒置培養9 d，測定直徑，分析各濃度抑菌劑對白及常見污染真菌抑制活性。

1.2.5 農用抑菌劑對白及種子萌發影響

分別稱取各抑菌劑適量，分散于MS固體培養基中，配成含抑菌劑濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的4種濃度的處理組，每組重復3次，121 ℃高壓滅菌30 min備用。無菌操作接種白及種子，置于25 ℃，3 000 lx光照下培養，每天光照培養12 h，培養20 d后統計種子萌發情況，分析不同抑菌劑不同濃度對白及種子萌發的影響。

1.2.6 農用抑菌劑對白及小苗分化、生長影響

分別稱取各抑菌劑適量，分散于MS固體培養基中，配成含抑菌劑濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的4種濃度處理組，每組3個重復，121 ℃高壓滅菌30 min備用。無菌操作接種已經在MS培養基中萌發30 d的白及小種球，置于25 ℃，3 000 lx光照下培養，每天光照培養12 h，繼續培養2個月后統計分析各抑菌劑對白及小苗分化、生長影響。

1.2.7 數據分析

結果以均數±標準差(x±s)表示，利用SPSS 13.0對數據進行分析處理，不同組間比較采用一維方差分析，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 白及種子母瓶接種污染率高

經消毒處理的白及果莢接種于MS培養基中培養20 d后統計污染情況。由圖1可知，白及果莢經上述消毒接種污染率較高，其中細菌污染率在4%左右，真菌污染率高達30%左右，且污染的真菌類型較多。有些真菌直接抑制白及種子萌發，有些種子雖能萌發，但很快褐化死亡，有些雖無明顯毒性，種子也能生長，但可能由于營養競爭而長勢較慢。白及果莢接種污染率高可能與白及果莢采集時間太晚、果莢開裂從而引發感染有關，也可能與其含有豐富的內生菌有關[6]。

最后一張為正常無污染母瓶圖1 白及母瓶真菌污染情況

2.2 農用抑菌劑對白及污染真菌抑制作用

通過PDA頂端純化法共分離純化上述白及常見污染真菌6株，切塊法接種于含有各抑菌劑的PDA培養基中，置于28 ℃，90%濕度恒溫培養箱中倒置培養9 d，測定直徑，分析各抑菌劑對白及常見污染真菌抑制活性。從表1中可以看出，多菌靈與代森錳鋅對6株白及常見污染真菌抑制效果較好，在0.05%濃度下，只有6號菌株有一定生長，其他生長全部得到完全抑制；百菌清在0.1%濃度下，除4號菌株有一定生長外，其他全部得到完全抑制，0.05%濃度時大部分生長抑制也比較明顯；總體上4號和6號菌株耐藥性相對較強。

表1 不同抑菌劑濃度對6株白及常見污染真菌抑制活性的影響

2.3 農用抑菌劑對白及種子萌發影響

抑菌劑在一定劑量范圍內往往對植物體也有一定的生長抑制或毒性，因此必須對其安全性進行評價。本研究對各抑菌劑設立4個濃度梯度，探討其對白及種子萌發和幼苗生長發育的影響，以明確其在白及組培生產中的應用可行性。從圖2中可以看出，通過20 d培養，對照組萌發率高達95%以上，葉片舒展，根系生長明顯呈白色。百菌清0.05%濃度萌發率大于90%，少量萌發后變褐死亡，葉片明顯短小，根系沒有或變短，根基部變褐色，表現為生長抑制，而0.1%以上濃度種子基本萌動后全部死亡，可見百菌清對白及種子萌發毒性較大。多菌靈0.05%濃度萌發率基本和對照相當，葉片舒展，根系明顯，部分甚至長于對照組；0.1%濃度處理組萌發率大于90%，少量萌發后變褐死亡，葉片、根系明顯縮短，根開始變褐色，表現出一定的生長抑制作用；0.2%濃度處理組萌發率大于70%，萌發后變褐死亡明顯增多，葉片短小，大部分未長根，生長抑制顯著；0.4%濃度處理組全部死亡。代森錳鋅0.05%濃度處理組種子有萌動變綠色小球，但未見葉片根系等組織分化，部分開始變褐死亡，0.1%以上濃度全部死亡，對白及種子萌發表現為較大毒性作用。可見多菌靈對白及種子萌發毒性相對較低，結合前述各抑菌劑對白及常見污染菌株抑制活性，其較適合用于白及種子萌發添加抑菌劑，既可有效預防白及母瓶污染，又可確保種子正常萌發生長；而百菌清次之，濃度不應高于0.05%；代森錳鋅毒性較大，不適合白及組培應用。

A～F分別表示空白對照、百菌清0.05%、多菌靈0.05%、多菌靈0.1%、多菌靈0.2%、代森錳鋅0.05%圖2 不同濃度抑菌劑對白及種子萌發的影響

2.4 農用抑菌劑對白及小苗分化、生長發育的影響

白及種子播種MS液體培養基，萌發培養30 d后轉接到含系列濃度抑菌劑的MS固體培養基中繼續培養2個月后統計各組白及小苗生長情況，結果如圖3和表2所示。對照組植株生長分化正常，平均株高在3.76 cm，根系和葉片較多，分別為5.55條和4.00片；除了含0.05%百菌清處理組株高和根數，0.1%百菌清和0.05%代森錳鋅處理組葉片數和對照組無顯著差異外，其他各處理組指標均表現出不同程度的生長抑制作用。含百菌清0.2%基本停止生長分化，0.4%全部褐化死亡；多菌靈各濃度雖都有一定生長分化，但隨濃度升高株高顯著變矮，葉片數變少，根系停止生長；代森錳鋅0.05%即對白及種子萌發完全抑制，但此濃度下白及小苗還能生長分化，但生長抑制現象明顯，而0.1%以上濃度全部褐化死亡，仍然表現出較大毒性。可見百菌清對種子萌發影響較大，但對應濃度對白及小苗生長分化影響較小，而多菌靈對白及種子萌發影響相對較小，但對應濃度對白及小苗生長抑制較百菌清明顯。因此，白及種子萌發母瓶適合選用多菌靈為抑菌劑，而小苗分化培養適合選用百菌清作為抑菌劑。

A～I分別表示空白對照組、百菌清0.05%、百菌清0.1%、百菌清0.2%、多菌靈0.05%、多菌靈0.1%、多菌靈0.2%、多菌靈0.4%和代森錳鋅0.05%圖3 各抑菌劑對白及小苗生長發育影響

組別株高/cm根數葉片數對照3.76±0.90e5.55±1.13d4.00±0.45d百菌清0.05%3.65±0.73e5.00±1.00d3.27±0.65ac百菌清0.1%2.48±0.38ab3.73±0.79a3.82±0.40d百菌清0.2%0.54±0.29f0e3.67±0.50dc多菌靈0.05%2.73±0.67a3.92±0.95a3.08±0.28abc多菌靈0.1%2.26±0.36b3.38±0.87ab3.15±0.38abc多菌靈0.2%1.59±0.39c2.58±1.08c2.92±0.29abc多菌靈0.4%1.05±0.22d2.54±0.66c2.85±0.55ab代森錳0.05%鋅2.29±0.90ab2.82±0.75bc3.73±0.47d

注：不同字母表示不同處理比較具有顯著性差異，P<0.05。

2.5 添加0.05%多菌靈對預防白及種子萌發污染效果

以MS為對照，配制含多菌靈0.05%的MS培養基，接種白及種子各100瓶，置于25 ℃，3 000 lx每天光照培養12 h，培養20 d后統計污染率。結果表明，未加抑菌劑的MS培養基真菌污染率達25%，附加0.05%多菌靈后污染率僅為2%，起到了很好的預防作用。

3 討論

植物組培因其快繁、脫毒等眾多優點已得到廣泛應用，但同時因其設備、人員操作、管理等要求較高，生產成本仍然較高。為此，不少學者采用培養基中添加抑菌劑的方式以便降低生產成本和提高生產效率，并已取得了良好效果，也由此產生了“開放式組培”這一新方法[7]。鑒于各抑菌劑在開放式組培中的成功應用，同時立足白及組培真菌污

染嚴重這一現實，本文開展了常用農用真菌抑菌劑百菌清、多菌靈和代森錳鋅在白及組培污染防治應用的可行性研究。從上述結果看，代森錳鋅對白及組培常見污染真菌抑制效果較好，但其對白及種子萌發毒性較大，不適合做萌發抑菌添加劑，同時其對白及幼苗分化生長抑制明顯，因此也不適合做繼代幼苗添加劑。百菌清對白及種子萌發毒性也較大，0.1%濃度種子已全部死亡，而且0.05%濃度對白及常見真菌不能實現完全抑制，因此也不適合作為白及種子萌發抑菌添加劑。無論是對白及種子萌發還是幼苗生長分化，多菌靈均表現出較低毒性，但0.1%以上濃度生長分化抑制較為明顯。因此，綜合考慮0.05%多菌靈是白及種子萌發較為理想的抑菌添加劑，而且進一步試驗驗證其可使白及種子母瓶真菌污染率降低至2%，有效解決了白及母瓶污染這一主要問題。繼代育苗培養整體污染率較低，鑒于0.05%百菌清對白及小苗生長發育影響較小，可以考慮作為繼代育苗抑菌添加劑，以減少組培污染損失。此外，還應從源頭把關，合理優化白及碩果采摘時間，以確保不因果莢開裂而增加污染機率。

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(責任編輯：張瑞麟)

2016-12-13

浙江省科技計劃項目(2015C32084)；中醫藥行業科研專項(201507002)

趙雙雙(1996—)，生物科學專業，E-mail：zhaoss0814@163.com。

李美芽，E-mail: lmeiya@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170429

S318

A

0528-9017(2017)04-0638-04

文獻著錄格式：趙雙雙，潘潔莉，劉巧，等. 農用真菌抑菌劑對白及種子萌發及小苗生長分化的影響[J].浙江農業科學，2017，58(4)：638-641.