大白菜葉柄黑點癥細胞顯微結構觀察

雷娟利，李必元，王五宏，岳智臣，陶 鵬，趙彥婷，鐘新民

(浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

大白菜葉柄黑點癥細胞顯微結構觀察

雷娟利，李必元，王五宏，岳智臣，陶 鵬，趙彥婷，鐘新民*

(浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

通過光學和電子顯微鏡技術對大白菜葉柄黑點癥細胞顯微結構進行觀察研究。光學顯微鏡觀測結果表明，大白菜葉柄上的黑點少則由2～3個細胞、多則由20～30個細胞組成；電子顯微鏡觀測發現，發生黑點癥的細胞細胞壁扭曲變形、葉泡和線粒體等細胞器降解破壞、多泡體形成、細胞核形狀發生改變、質壁分離等典型的植物細胞程序化死亡的基本特征，由此推測，大白菜葉柄黑點癥是大白菜在受到過量氮肥等逆境條件下發生植物細胞程序性死亡的結果。

大白菜； 葉柄黑點癥； 顯微結構； 細胞壁； 植物細胞程序性死亡

大白菜起源于中國，營養較豐富(含有蛋白質、脂肪、多種維生素和多種礦物質及大量的膳食纖維)，具有悠久的栽培歷史，是歷代勞動人民長期培育出來的中國特產蔬菜。大白菜葉柄黑點癥嚴重影響大白菜的品質，降低商品價值，給生產者、經營者和消費者造成巨大損失。大白菜葉柄黑點癥是指大白菜結球葉葉柄表面發生的小黑點樣病變，這種小黑點樣病變可發生于葉柄內外側，尤其以內側表面更為嚴重，有時也可發生在葉脈處的內外側表面。病斑主要集中在表皮層細胞，少有的也發生在葉肉細胞。病斑大小多為1～2 mm，有的病斑則需放大鏡才可見。病斑發展到后期，可使葉柄發生褐變及表皮開裂以至腐爛。除生長過程外，大白菜葉柄黑點癥在貯藏過程中還會加重，甚至在收獲時沒有病征的大白菜在貯運中也能發生。另外，反季節栽培的大白菜，葉柄黑點癥發生更嚴重。楊曉云等[1-2]根據其表現特征及英文名稱稱之為“大白菜小黑點病”或“大白菜芝麻狀斑點病”。

引起大白菜葉柄黑點癥發生的機制尚不完全清楚。已有研究表明，大白菜葉柄黑點癥是一種生理性病害，為基因型和環境因素共同作用的結果，過量施用N肥是引起此癥的重要因素[3]。本課題組研究發現，有機肥也可影響大白菜葉柄黑點癥的發生[4]。到目前為止，未見有關對大白菜葉柄黑點癥開展過細胞顯微結構觀察研究的相關報道。本文對大白菜葉柄黑點癥細胞進行了光學和電子顯微鏡的觀察研究，從細胞水平對大白菜葉柄黑點癥發生的機理進行了探討，為大白菜葉柄黑點癥的發生機制研究及抗性育種工作提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為浙江省農科院楊渡基地大白菜甘藍課題組的大白菜材料，取自2013春至2015年春，對其進行葉柄黑點癥觀察、拍照，并取樣用于光學及電子顯微鏡觀察。

1.2 光學顯微鏡樣品制備與觀察

從田間取回的樣品，用自來水清洗，用吸水紙吸干凈水分，取有黑點癥狀的部分進行光學顯微鏡觀察、拍照。

1.3 透射電鏡樣品制備與觀察

將從田間取回的樣品用自來水清洗，用吸水紙吸干凈水分，包含黑點取0.1 cm×0.5 cm葉樣，迅速投入5%的戊二醛(0.1 mol·L-1PBS，pH值7.0配制)內固定，抽氣直到材料下沉為止，于4 ℃冰箱中固定24 h，用0.1 mol·L-1PBS沖洗，而后用1%餓酸溶液固定4 h，再經雙重蒸餾水沖洗，乙醇系列脫水，Epon812環氧樹脂包埋，徠卡公司UC6型超薄切片機切片，經醋酸雙氧軸和檸檬酸鉛染色，于日立公司H-7650型透射電鏡下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 大白菜葉柄黑點癥田間各種癥狀

大白菜葉柄黑點癥的典型癥狀是葉柄表面出現黑褐色的小點，黑點大小以1～2 mm較常見(圖1中A)，也有的黑點大小僅為0.1～0.5 mm，在葉柄表面呈又密又小淡黑色的一片(圖1中B)。黑點癥狀一般發生在葉柄內表面，也經常發生在葉柄的外表面或葉脈處(圖1中C)。黑點大多都發生在葉柄的表皮細胞，也有的發生在葉肉細胞(圖1中D)，在大白菜生長后期，葉柄黑點癥常表現為葉柄發生褐變(圖1中E)、葉柄表皮開裂(圖1中F)，甚至腐爛(圖1中G)?？傊?，葉柄黑點癥的癥狀有多種表現形式，因品種、環境因素及生育期的不同而異。

2.2 大白菜葉柄黑點癥細胞光學顯微鏡觀察結果

圖2看出，對大白菜葉柄黑點癥發病葉柄上的小黑點在光學顯微鏡下觀察可知，1～2 mm黑點通常發病細胞由幾十個細胞組成，整個細胞壁都有黑色物質沉積，細胞內也呈淡黑褐色，大液泡已遭破壞(圖2中A)。黑點又密又小的發病細胞僅為幾個，黑色物質僅局限在邊角處，大液泡尚可見(圖2中B)。對葉肉細胞發病的黑點進行觀察可知，表皮細胞大液泡清晰可見，黑色物質在表皮下(圖2中C)。

A為大液泡已遭破壞，B為大液泡尚可見，C為黑色物質在表皮下圖2 大白菜葉柄黑點癥細胞光學顯微鏡觀測結果

2.3 大白菜葉柄黑點癥電子顯微鏡觀察結果

如圖3中A～C為正常的大白菜葉柄表皮細胞，可看到細胞豐滿，大液泡幾乎充滿整個細胞，細胞器被擠到細胞壁附近薄薄的一層。放大可見細胞器完整，邊界清晰。圖3中D～L為發生黑點癥的細胞。從圖3中D可見，發病細胞細胞壁扭曲變形，細胞角質層明顯增厚，扭曲變形處有黑色物質，放大后由圖3(E～F)可見，有的細胞器外形已不可見，有的細胞器膜上則布滿小黑點。結果表明，黑點癥的細胞壁發生嚴重扭曲變形，內部細胞器遭到嚴重破壞，細胞已死亡。

A～C為正常的大白菜葉柄表皮細胞，D為發病細胞，E～F有的細胞器外形已不可見，有的細胞器膜上則布滿小黑點，G為正在發病的細胞器，H為開始發生質壁分離的細胞，J～K為細胞膜上形成的一個嵴狀結構，L是一變形細胞核圖3 大白菜葉柄黑點癥細胞電子顯微鏡觀測結果

圖3中G顯示的是正在發病的細胞器，可見一個基本正常的細胞器，然后其他細胞器的膜上開始出現黑色物質，黑色物質越來越多，細胞形狀逐漸消失。可見液泡膜和細胞膜上也有黑色物質沉積，部分液泡膜已遭到破壞。圖3中H顯示的是一個開始發生質壁分離的細胞部分，細胞器受損變形，細胞膜也受損變形，且與細胞壁發生了分離。圖3中I顯示的是一個幾乎完整發生質壁分離的細胞，細胞壁已稍有變形。

圖3(J～K)顯示細胞膜上形成的一個嵴狀結構，在一個基本正常的表皮細胞里由細胞膜處衍生出一個較大的嵴狀結構(圖3中J)，放大后發現，是由一層層的膜構成的，且中間膜較疏松，而外部的膜則較緊密(圖3中K)。這種嵴狀結構一般在植物遇到逆境脅迫時出現，表明葉柄黑點癥的發生是受到某種逆境脅迫。

圖3中L是一個變形細胞核，細胞核不再是圓潤的，而是皺縮的，且產生了許多指狀結構，表明細胞核也受到了破壞。

3 小結與討論

大白菜葉柄黑點癥是一種生理性病害，過量施用N肥是本病加重的一個重要因素。劉東等[4]開展了氮素濃度對大白菜小黑點病發生的影響，結果均表明，氮濃度對感病品系03B9和P8-2的細胞膜透性和 MDA 含量的影響比抗病品系C24和P8-1大，推測感病品系細胞膜結構遭到破壞，使細胞膜透性增大并發生脂膜過氧化反應，表現出電導率增大及MDA含量的升高，這可能是小黑點發生的原因。在本研究中，通過電子顯微鏡觀察結果證實了這一推測，在多張不同的照片中顯示了細胞器膜，液泡膜及細胞膜遭到了破壞。而發展的過程是先有黑色物質在細胞膜上沉積，隨著黑色物質的增加，細胞膜逐漸受到降解破壞。這表明大白菜葉柄黑點癥的發生與細胞膜受損有關。

植物細胞程序性死亡(programmmed cell death，PCD)普遍存在于植物體生長發育過程中，是由特定基因控制的細胞主動死亡的現象。植物細胞程序性死亡不僅對正常植物的生長發育是必不可少的，而且在抵御病原體入侵及植物響應非生物環境脅迫過程中也起著重要的作用[5]。本研究中發現了許多現象，如細胞壁的扭曲變形、細胞核畸形、多泡體出現、細胞質壁分離等都是典型的植物細胞程序性死亡的基本特征。因此，大白菜葉柄黑點癥也可能是大白菜在過量氮肥等逆境條件下的植物細胞程序化死亡的結果。

細胞壁扭曲變形是引起大白菜葉柄黑點癥發展后期表皮開裂的主要原因，由于表皮層開裂，使內部細胞失去保護，導致病原微生物進入，進而引起葉柄腐爛。

[1] 楊曉云，張淑霞，張清霞，等. 氮肥對大白菜生理障害——小黑點病發生影響的初步研究[J]. 華北農學報，2006，21(增刊)：151-153.

[2] 郭瑩，楊曉云，司朝光，等. 不同形態氮素營養對大白菜芝麻狀斑點病發生的影響[J]. 園藝學報，2011，38(8)：1489-1497.

[3] 雷娟利，鐘新民，李必元，等．有機肥對大白菜葉柄黑點癥及葉緣黑點癥的影響[J]．浙江農業科學，2015，56(10)：1593-1597.

[4] 劉東，楊曉云，王媛，等. 氮素濃度對大白菜小黑點病發生的影響[J]. 中國農學通報，2010，26(11)：303-307.

[5] 李云霞，程曉霞，代小梅，等. 植物在逆境脅迫中的細胞程序性死亡[J]. 生物技術通報，2009(4)：7-11.

(責任編輯：張瑞麟)

2017-01-18

浙江省自然科學基金(LY14C150003)；浙江省重點創新團隊“園藝作物育種技術創新團隊”項目(2013TD05)

雷娟利(1971—)，副研究員，博士，從事白菜抗病育種研究工作，E-mail: juanlil@126.com。

鐘新民，研究員，E-mail:zxmlly@hotmail.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170443

S436.5

A

0528-9017(2017)04-0688-03

文獻著錄格式：雷娟利，李必元，王五宏，等. 大白菜葉柄黑點癥細胞顯微結構觀察[J].浙江農業科學，2017，58(4)：688-690，694.