雨生紅球藻藻渣在成年虹鱒飼養中的應用

石焜++蘇芳++郭文++胡發文++龐通++高振++劉建國

摘要：選用已喂食人工蝦青素6個月的2年齡3倍體雌性虹鱒成魚，分別繼續投喂人工蝦青素強化飼料（原有飼料，含40 mg/kg人工蝦青素）、雨生紅球藻藻渣強化飼料（替代飼料，含40 mg/kg天然蝦青素）及無任何蝦青素的基礎飼料（空白對照組）。飼喂24 d后，對比研究了上述各組處理對虹鱒生長性能、肌肉品質、蝦青素含量及抗氧化能力等指標的影響。結果表明，2種蝦青素強化飼料在虹鱒生長性能、肌肉品質方面無顯著差異（P>0.05），但較空白對照組有小幅改善；藻渣強化組虹鱒背肌的肉色比色卡值較人工蝦青素強化組有一定提升，但差異不明顯；藻渣強化組虹鱒背肌的總類胡蘿卜素及蝦青素含量顯著高于人工蝦青素組（P<0.05），表明藻渣中天然蝦青素更易在虹鱒背肌中累積；藻渣強化組的T-AOC及MDA數據明顯優于人工蝦青素強化組，差異極顯著（P<0.01），表明藻渣中天然蝦青素對于虹鱒的抗氧化能力提升更明顯，去除自由基能力更強。上述結果表明，雨生紅球藻藻渣可以作為人工蝦青素的有效著色替代品，在虹鱒飼料添加劑市場中具有開發潛力。

關鍵詞：成年虹鱒；蝦青素；雨生紅球藻藻渣；飼料添加劑；抗氧化能力

中圖分類號： S963.73+5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0153-04

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）是一種鮭科類的高價值冷水性養殖魚，其肌肉的色度是衡量肉質的重要指標[1]，該指標主要受到所攝取蝦青素、角黃素等類胡蘿卜素的影響[2]。在實際養殖過程中，可通過在飼料中添加蝦青素的方法強化虹鱒的著色。市場上的飼料著色劑主要分為天然和人工2種蝦青素，其中以人工蝦青素為主[3]。然而，天然蝦青素在安全性、結構和有效性上有諸多優勢，近年來日益受到關注[4-5]。美國食品和藥物管理局（FDA）評估只允許天然蝦青素進入保健品市場，明確禁止人工蝦青素的進入[6]。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是規模生產天然蝦青素的最主要來源，提取蝦青素后的藻渣中仍含有大量多糖、豐富的蛋白質及殘余的天然蝦青素，具有較高的開發利用價值，尤其是在高價值飼料添加劑方面的應用潛力巨大。目前，國內外有關雨生紅球藻藻渣在水產飼料應用方面的文獻報道甚少，僅有Ju等將藻渣用作蝦類養殖飼料中蛋白質源替代的報道[7]，但對藻渣中蝦青素組分的利用并未重點涉及。

在虹鱒養殖中，飼料中蝦青素的添加成本占飼料總成本的10%～20%[8]，為降低成本，實際生產中僅在養殖后期（即出池前3～6個月）投喂蝦青素飼料進行著色，并在最后1個月飼喂高蝦青素的飼料予以短期強化。在目前諸多蝦青素強化虹鱒著色的研究中，多以200 g以下的早期幼年魚體為試驗材料[9-11]，而與水產養殖更密切相關的成魚著色卻鮮有報道。幼魚與成魚在器官發育程度、攝食、消化和吸收能力以及肉質著色力存在一定的偏差甚至不同，為避免研究與實際應用出現明顯錯位。為此，本試驗以著色6個月的2年齡虹鱒成魚為對象，利用雨生紅球藻藻渣作為飼料中蝦青素的替代源，對比觀察其著色飼喂過程中生長性能、肌肉品質、蝦青素含量與組成、抗氧化能力等的可能變化，目的探討雨生紅球藻藻渣在高端水產飼料開發中應用的可能性。

1材料與方法

1.1試驗飼料

試驗各組投喂飼料的主要營養指標見表1。人工蝦青素組為含40 mg/kg人工合成蝦青素的商業化強化飼料（ALLER SILVER），除蝦青素外其他成分與基礎飼料營養相同。本試驗所用雨生紅球藻藻渣由云南愛爾發公司提供，蝦青素有效含量為0.5%。將藻渣加入適量蒸餾水，于130 MPa下高壓均質1 min得到藻渣均質液。將基礎飼料粉碎，40目過濾后，添加藻渣均質液、黏合劑及蒸餾水，重新制成直徑小于1 cm的天然蝦青素強化飼料顆粒（含40 mg/kg天然蝦青素）。上述強化飼料于4 ℃避光保存，3 d內投喂。各組投喂飼料的配方組成詳見表2。

1.2試驗用魚與試驗設計

試驗在山東省海洋生物研究院鰲山衛基地進行，試驗用虹鱒由山東省海洋生物研究院提供的三倍體雌魚。虹鱒體質

量為（1 047.1±288.3） g，2年齡，已喂食含有40 mg/kg人工蝦青素飼料6個月。試驗分3組，分別為基礎飼料對照組，含有40 mg/kg人工蝦青素組和含有40 mg/kg天然蝦青素的藻渣強化組。每組1池，每池（180±20）尾虹鱒。池規格為 5.60 m×5.60 m×1.80 m，水深0.70 m。

1.3飼養管理

試驗用水為地下咸水，鹽度2.6%～2.7%，溶解氧6.0～7.0 mg/L，水溫16.0～17.0 ℃，換水率5～7池/d，光照為自然漫散光。試驗開始前，虹鱒預先在池中馴養3周以適應新環境。試驗正式開始前，禁食24 h。每天分別于09：00和 15：00 各喂食1次，日飼喂量（干質量）約為2.0 g/尾。具體飼喂量隨著水溫、換水率、溶氧及進食狀況相應微調，以無殘餌為適宜。每天06：30撈取糞便查看進食的消化吸收情況。試驗喂養從2015年5月22日開始到6月15日為止，共計 24 d。

1.4測定指標與方法

取樣前停食饑餓24 h。每池隨機取魚3尾，以丁香油麻醉，小錘敲擊頭部致暈，采集樣品。

1.4.1常規生長指標在試驗結束時，分別測量各試驗組虹鱒的體長度、體質量及肝臟質量，并按照下式計算肥滿度、肝體比：

肥滿度=體質量（g）/體長度（cm）3×100%；

肝體比=肝質量（g）/體質量（g）×100%。

1.4.2比色卡值取側線與背脊之間白肌部分。4 ℃ 0.86% 生理鹽水沖洗血污，濾紙吸干表面。使用SalmoFanTM Lineal比色卡尺測量朝向背脊的一面，每尾魚的雙側測量各1次。

1.4.3滴水損失背部取肌肉約2 g。將肉樣稱質量（m1），用細鐵絲鉤住肉樣一端，保持肉樣垂直向下，懸吊于4 ℃，分別于12、24、36、48 h時，取出肉樣，用濾紙拭去肉樣表層的液體，然后稱質量（m2），按下式計算：

滴水損失=[（m1-m2）/m1]×100%。

1.4.4含水率采用105 ℃恒重法（GB/T 6435—1986）。

1.4.5背肌的總類胡蘿卜素分別取側線以上的背脊白肌部約4 g的肉塊2份，精確稱量于冰盤上用眼科小剪剪碎，按質量體積比1 ∶1加入正己烷和95%乙醇混合試劑，組織采用12 000 r/min勻漿至懸濁液狀。低速離心機3 500 r/min，4 ℃ 低溫離心10 min。取上清液，于487 nm下測定吸光度值。根據標準曲線計算出含量。

1.4.6背肌蝦青素含量及組成分析取側線以上的背脊白肌部分取約4 g的肉塊2份，依據“1.4.5”節方法，取上清液，下層肌肉組織繼續加入正己烷和95%乙醇混合試劑，重復上述操作直至肌肉呈白色、上清無色為止。將多次萃取的上清液合并后定容，即為待測樣品溶液。

蝦青素幾何及旋光異構體測定采用安捷倫1200高效液相色譜儀，以色譜柱Luna 3u Silica （2） 100 A 150 mm×4.60 mm（phenomenex）進行幾何異構體測定，以CHIRALPAK IC 4.6×250 mm（Daicel）進行旋光異構體的分析。樣品用流動相溶解，幾何異構體測定和立體異構體測定的流動相分別為正己烷和丙酮（體積比83 ∶17），甲基叔丁基醚和乙腈（體積比36 ∶64），流速1.0 mL/min，檢測波長為478、476 nm，進樣量20、10 μL。蝦青素含量采用單點外標法測定。

1.4.7抗氧化指標血清總抗氧化能力（T-AOC）測定：用一次性5 mL注射器和12號針頭，取虹鱒尾部靜脈血，轉入 1.5 mL 離心管中，于4 ℃冰浴2～4 h。在4 ℃按8 000 r/min離心10 min，取上清液。測定采用南京建成試劑盒，具體方法依照其說明書進行。測定原理為抗氧化物質使Fe3+還原為Fe2+，后者與菲林類物質形成穩固絡合物，經由比色測出高低。

肝臟總蛋白（TP）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）的測定：解剖取全部肝臟，置于 -80 ℃ 中保存。測定采用南京建成試劑盒，具體方法依照其說明書進行。TP采用考馬斯亮蘭法測定；T-SOD使用黃嘌呤氧化酶法測定；CAT采用可見光法測定；MDA使用TBA法測定。

1.4.8計算與統計分析試驗數據采用（平均數±標準誤）表示，使用SPSS 17.0進行單因素方差分析，結合Duncans法進行多重比較。

2結果與分析

2.1不同來源蝦青素對虹鱒生長性能的影響

各試驗組魚質量、體長度、豐滿度、肝體比等生長指標（表3），與對照相比均無顯著性差異（P>0.05）。該結果與Foss等、Thompson等所報道的蝦青素對虹鱒魚生長性能無顯著影響的結論[12-13]相符。表3試驗數據還顯示，盡管魚質量、體長度及肝體比未達到顯著差異程度，但強化組較空白對照組均有小幅提升；藻渣強化組較人工蝦青素強化組在魚質量、肥滿度及肝體比數據上也有小幅提升。這可能與雨生紅球藻藻渣中所含的多糖及蛋白質等營養組分有關，文獻報道紅球藻可以顯著提高太平洋白對蝦（Penaeus vannamei）生長速率并降低飼料系數[7]。可能本試驗中所添加的藻渣量較小，而未能獲得明顯促進生長的效果。

2.2不同來源蝦青素對虹鱒背肌含水量及滴水損失的影響

魚類肌肉含水量與肌肉品質存在顯著相關性，對肌肉品質產生重要影響[14]，Josephson等使用虹鱒的全魚含水量作為

反映其能量貯存水平和脂質含量的替代指標[15]。表4對比了各組之間背肌含水量和0～72 h的滴水損失。不同處理組虹鱒背肌含水率并無顯著性差距（P>0.05），表明不同來源的蝦青素對背肌品質無明顯影響。

滴水損失反映肌肉的保水性，也是反映肌肉品質的重要指標，滴水損失越低則肉質越佳。張娟娟研究表明，蝦青素對于背肌的貯存性能有一定改善作用[16]。但在本試驗的各個時間點上，無論藻渣強化組還是人工蝦青素強化組，均與空白對照組沒有顯著性差異（P>0.05），即滴水損失數據并未呈現出與張娟娟的研究[16]相類似的結果。這可能與本試驗所用成魚已投喂含蝦青素飼料6個月，肌肉已保有相當多的蝦青素有關。之前有關蝦青素在虹鱒體內降解代謝的研究表明，在停止喂食蝦青素4周后，虹鱒肌肉中蝦青素含量仍可保留50%以上[17]。因此，可以認為在停止攝取蝦青素24 d后，虹鱒體內殘留的蝦青素仍具有較強改善肉質的能力，這可有效解釋各試驗組之間肉質差異不明顯的原因。

2.3不同來源蝦青素對虹鱒背肌肉色及對其積累總類胡蘿卜素和蝦青素的影響

由表5可見，各組間背肌比色卡值差異不明顯（P>0.05），顏色均為橙紅色。其中，藻渣強化組較空白對照組數據有一定提升（8.21%），而人工蝦青素強化組與對照組幾乎一致。藻渣天然蝦青素較人工蝦青素著色更佳，說明天然來源的雨生紅球藻藻渣完全可以替代人工蝦青素，提高虹鱒成魚背肌著色，這與Bowen等的研究結果[18]也是一致的。

在虹鱒背肌的總胡蘿卜素和蝦青素含量方面，人工蝦青素強化組與空白對照組并無明顯差距（P>0.05），而藻渣強化組則有顯著提高（P<0.05），這與比色卡值反映的趨勢基本相同。說明較之人工蝦青素，藻渣中天然蝦青素更易于在虹鱒背肌中累積，促進魚肉著色。Kurnia等對比了海洋細菌（marine bacteria）源天然蝦青素與人工蝦青素對于虹鱒的沉積效果，發現天然蝦青素提高肉色效果更佳[9]，這與本試驗結果也是一致的。推測這可能與雨生紅球藻所含蝦青素及其脂類配比與動物體內的蝦青素配比相似有關，雨生紅球藻中的蝦青素以3 S、3′ S構型為主，與動物體內的蝦青素構型基本一致，可能有助于機體對蝦青素的快速吸收[6，19]，而人工蝦青素不具備天然蝦青素的上述特性。

由表6可知，在虹鱒肌肉中，盡管蝦青素幾何異構體沒有明顯差異（P>0.05），但立體異構體數據存在一定差異。藻渣強化組，其3S、3′ S蝦青素異構體有所增加，表明紅球藻天然蝦青素有逐步替代虹鱒體內前期積累的人工蝦青素的趨勢。從空白對照組結果可以看出，隨著停止攝取人工蝦青素，背肌中蝦青素含量及異構體組成的消退過程是緩慢的，從另一個角度也說明雨生紅球藻藻渣可有效保持虹鱒肉色質量。此外，各組中左旋蝦青素積累均大于右旋蝦青素積累，這可能與蝦青素立體異構體在鮭鱒魚不同組織間的選擇性積累有關[20]，從另一側面也再次為左旋結構蝦青素更有利于鮭鱒魚肌肉增色提供了數據支持[21]。

2.4不同來源蝦青素對虹鱒血清及肝臟的抗氧化指標影響

魚類機體的防御與酶促和非酶促2個體系有密切關系。其中，酶促體系包括SOD、CAT等內源酶，而非酶促體系則包

括各類具有抗氧化作用的維生素、類胡蘿卜素等物質。本試驗抗氧化指標中，T-AOC是機體淬滅自由基和抗氧化能力的總和，也是衡量整個機體酶促及非酶促2個體系抗氧化能力的綜合指標。SOD和CAT活力高低，分別反映了體內防御體系清除超氧陰離子自由基及羥自由基的能力，2個指標間關系是明確的，SOD所催化的反應產物過氧化氫，也是CAT催化反應的底物。而MDA高低則反映機體內脂質過氧化的程度，能間接反映出細胞受到自由基攻擊的損傷程度。MDA與CAT的測定是互相配合的。

根據表7數據比較可知，各處理組虹鱒血清的T-AOC，其中飼喂蝦青素強化的2組均較空白對照組有所提升，特別是藻渣強化組差異極顯著（P<0.01），是空白對照組的 302.08%，遠遠高于人工蝦青素強化組的提升（19.6%）。這表明藻渣中的天然蝦青素比人工蝦青素對虹鱒機體綜合抗氧化能力的提高更為有效。

進一步分析試驗3組MDA含量發現：2種蝦青素強化組較空白對照組都有極顯著下降。其中藻渣強化組下降幅度更大，表明藻渣中所含天然蝦青素較人工蝦青素清除自由基的能力更強，這與血清T-AOC數據所反映的總體趨勢也是相符的。

此外，對比3組肝臟T-SOD、CAT的活力，發現藻渣強化組和人工蝦青素強化組相比空白對照組均有下降，但內部并無顯著性差異。Pan等在斑點對蝦Penaeus monodon的飼料中添加了蝦青素，發現其血淋巴中T-AOC升高而SOD活力下降[22]，本試驗的數據趨勢與之吻合。分析原因可能是蝦青素對自由基的超強清除作用[23]，使得機體內非酶促抗氧化體系極大增強，機體的總抗氧化能力隨之提高。而隨著體內的活性氧大量被蝦青素猝滅，SOD與CAT的底物含量減少，導致二者酶活力的下降。

3結論

本試驗條件下，在虹鱒成魚飼養過程中使用雨生紅球藻藻渣代替人工蝦青素作為蝦青素源著色添加劑。結果表明，藻渣強化組在生長性能及肌肉品質上的提升較小；肉色方面有一定改善。藻渣中天然蝦青素在魚體中更易累積，并極大提升了其抗氧化能力。在虹鱒成魚的飼養應用中，雨生紅球藻藻渣可作為人工蝦青素的有效著色替代品。

致謝：本試驗用虹鱒魚由山東省海洋生物研究院提供，在養殖管理、樣品采集和解剖過程中獲得山東省海洋生物研究院高鳳祥、李莉、菅玉霞、王雪、劉建盛等的熱情幫助，在此一并表示衷心感謝。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.041