核桃青皮乙酸乙酯提取物對(duì)煙蚜的防治作用

何念武，趙秦，魏佳樂

（商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

煙蚜（Myzus persicae），又名桃蚜，屬于昆蟲綱同翅目蚜科昆蟲，遍布世界各地，在我國(guó)華北地區(qū)每年發(fā)生10余代，南方則高達(dá)30～40代，世代重疊極為嚴(yán)重，繁殖速度非常快，嚴(yán)重危害我國(guó)各產(chǎn)煙區(qū)煙草作物的正常生長(zhǎng)，給廣大煙葉種植區(qū)帶來了嚴(yán)重危害。一直以來，對(duì)煙蚜的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，在一段時(shí)期內(nèi)，化學(xué)防治法占據(jù)著主導(dǎo)地位，但是隨著化學(xué)農(nóng)藥的日益濫用，其負(fù)面影響也逐漸顯現(xiàn)，諸如煙蚜產(chǎn)生了明顯的抗藥性，殺傷煙蚜天敵，生態(tài)失衡和嚴(yán)重的環(huán)境污染等問題[1-2]。為了解決這一突出問題，廣大研究人員將目光轉(zhuǎn)向了生物防治。首先從植物中提取活性成分，繼而通過一定手段將其制成生物農(nóng)藥以便用于煙草病蟲害防治，取得了明顯的成效[3]。

核桃青皮，藥材名為青龍衣(Cortex Juglans Mandshuricae)，始載于《開寶本草》，為核桃未成熟果實(shí)的外果皮，夏末秋初采收，脫皮機(jī)切制而成，再曬干或烘干。據(jù)報(bào)道核桃青皮中富含胡桃醌、多糖等活性成分[4-5]，具有鎮(zhèn)痛、抗癌、抑菌等功效[6-7]。商洛作為全國(guó)主要核桃產(chǎn)地，對(duì)于核桃副產(chǎn)物核桃青皮的研究則甚少，更談不上綜合開發(fā)利用。鑒于此，本文擬開展核桃青皮乙酸乙酯提取物的分離制備，繼而探討其對(duì)煙草蚜蟲的生物防治作用，以實(shí)現(xiàn)廢棄資源再利用和效益的最大化。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃青皮，采自商洛市洛南縣古城鎮(zhèn)中山村(N 34°1′29″；E 110°33′3″，海拔 800～1215 m)，煙苗、煙蚜于2016年5月源于洛南縣永豐冀洼村煙葉基地。農(nóng)藥吡蟲啉，購于江蘇克勝集團(tuán)股份有限公司，乙酸乙酯等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

將采集的核桃青皮自然晾干或放置于烘箱中烘干，干燥后粉碎，過60目篩，粉末儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乙酸乙酯提取物制備及含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取核桃青皮粉末100 g，加5倍量乙酸乙酯于25℃下浸泡24 h，然后超聲輔助回流提取，每次超聲提取30 min，抽濾，殘?jiān)?倍量乙酸乙酯反復(fù)提取，重復(fù)3次。合并3次濾液，萃取，濃縮，干燥，備用。

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定提取物中胡桃醌含量[8]。

1.2.3 煙草蚜蟲的飼養(yǎng)

供試煙蚜收集于陜西省洛南縣冀洼煙葉種植基地，挑選形態(tài)大小較一致、體型健碩的煙蚜作為實(shí)驗(yàn)供試蟲，飼養(yǎng)于昆蟲飼養(yǎng)籠內(nèi)。

1.2.4 乙酸乙酯提取物對(duì)煙蚜的防治效果測(cè)定

1）對(duì)煙蚜的毒殺作用測(cè)定方法：采用梁永鋒[9]的噴霧法進(jìn)行并做適當(dāng)調(diào)整，加大實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)和供試煙蚜數(shù)量。將配制好的系列樣品溶液（1.0～20.0 mg·mL-1）均勻噴灑在事先剪好的煙葉上，以每皿100片煙葉和20頭煙蚜為一個(gè)實(shí)驗(yàn)單位。取直徑14 cm清洗干凈的培養(yǎng)皿15個(gè)，鋪上濾紙和大小一致的煙草葉片，將供試煙蚜放入培養(yǎng)皿中，不蓋皿蓋，用四層紗布封閉以防煙蚜逃逸。以10 mg·mL-1市售農(nóng)藥吡蟲啉作為陽性對(duì)照，乙酸乙酯溶液為正常對(duì)照組。置于昆蟲飼養(yǎng)籠中放置在事宜的條件下分別培養(yǎng)24 h和48 h后，觀察煙蚜死亡情況，煙蚜死亡率和校正死亡率的計(jì)算公式分別為：

死亡率=(死亡煙蚜數(shù)/供試煙蚜總數(shù))×100%

校正死亡率=［(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)］×100%

2）對(duì)煙蚜拒食活性的測(cè)定方法：樣品配置和實(shí)驗(yàn)分組安排同1.2.4中1）。不同之處在于煙葉裁剪時(shí)面積是之前的5倍，實(shí)驗(yàn)前將煙葉分別浸蘸樣品溶液10 s后取出，在煙葉背部放置10頭煙蚜，其余操作同1.2.4中的1），分別在飼養(yǎng)24 h和48 h后觀察各實(shí)驗(yàn)處理葉片上煙蚜的棲息數(shù)量，每處理重復(fù)5次，拒食率的計(jì)算公式為：

拒食率（%）=1-處理葉片煙蚜數(shù)/對(duì)照葉片煙蚜數(shù)×100%

3）作用時(shí)間對(duì)煙蚜拒食活性的影響評(píng)價(jià)方法

參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用2016版Excel進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮提取物中胡桃醌的含量

由圖1可以看出，胡桃醌標(biāo)品色譜峰在22.0～22.5 min出現(xiàn)，而提取物色譜圖出峰較多，主要是含有其他成分的緣故。由外標(biāo)法計(jì)算出乙酸乙酯提取物中的胡桃醌含量為24.5 mg·g-1。

2.2 乙酸乙酯提取物對(duì)煙蚜毒殺作用

由表1可知，不同濃度的乙酸乙酯提取物在作用24 h后，對(duì)煙蚜有明顯的毒殺作用，隨著提取物濃度的升高，其死亡率和校正死亡率都在升高，呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。正常對(duì)照組毒殺作用不明顯，而陽性對(duì)照組的作用效果較明顯。當(dāng)提取物濃度為20 mg·mL-1時(shí)，死亡率和校正死亡率最高，死亡率為43.13%，校正死亡率為 42.56%，其毒殺效果略高于陽性對(duì)照組。

圖1 胡桃醌和核桃青皮提取物HPLC圖

不同濃度乙酸乙酯提取物作用48 h后，毒殺效果比24 h的更加明顯。這說明提取物的毒殺作用不僅與濃度有關(guān)，也與時(shí)間有關(guān)，這為后續(xù)探究相同濃度在不同時(shí)間對(duì)煙蚜的拒食活性提供了依據(jù)。從表1中可以看出，當(dāng)提取物濃度為20 mg·mL－1，在處理 48 h 后，毒殺活性最高，死亡率為66.35%，校正死亡率為65.81%。正常對(duì)照組毒殺效果依舊不明顯，與陽性實(shí)驗(yàn)相比較，提取物濃度為20 mg·mL－1時(shí)，毒殺作用效果更明顯，校正死亡率和死亡率都比較高。

表1 核桃青皮提取物對(duì)煙蚜的觸殺作用/%

2.3 核桃青皮提取物對(duì)煙蚜的拒食活性

從表2中可以看出，核桃青皮乙酸乙酯提取物不同濃度對(duì)煙蚜的拒食作用有明顯的影響，作用24 h后，隨著濃度升高，拒食活性逐漸增大。陽性對(duì)照組拒食率相對(duì)較高，與之前的毒殺作用實(shí)驗(yàn)相比，拒食活性實(shí)驗(yàn)也存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，而正常對(duì)照組的拒食率相對(duì)很低，對(duì)煙蚜幾乎沒有影響。

當(dāng)提取物濃度為20 mg·mL-1時(shí)，處理48 h后拒食率最高，為70.22%，拒食率略高于陽性對(duì)照組。而正常對(duì)照組的拒食率在24 h和48 h時(shí)都很低，對(duì)煙蚜幾乎沒有影響。陽性對(duì)照組隨時(shí)間的增加，對(duì)煙蚜的拒食率也在逐漸升高。

在研究不同濃度提取物對(duì)煙蚜的毒殺作用和拒食活性實(shí)驗(yàn)中，也存在一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，但是由于只設(shè)定了24 h和48 h兩個(gè)時(shí)間段。為了更好的說明這一點(diǎn)，繼而對(duì)作用時(shí)間進(jìn)行了考察，從表3中可以看出，同一濃度的提取物在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)煙蚜有一定的拒食活性，隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，拒食率越來越高，在48 h時(shí)，拒食率達(dá)到最高為42.3%，在72 h后拒食率又降低。這說明在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，核桃青皮的提取物對(duì)煙蚜存在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。陽性對(duì)照組的拒食率隨著時(shí)間的推移，也在升高；正常對(duì)照組幾乎沒有太大變化。

表2 煙蚜對(duì)不同濃度的核青青皮提取物的拒食率/%

表3 作用時(shí)間對(duì)煙蚜的拒食率/%

3 結(jié)論與討論

不同濃度的乙酸乙酯提取物在相同時(shí)間以及同一濃度不同時(shí)間均會(huì)對(duì)煙蚜產(chǎn)生不同程度的毒殺和拒食活性，隨著濃度和時(shí)間的不斷增大或延長(zhǎng)其毒殺作用和拒食活性都在逐漸增大，并且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，說明核桃青皮乙酸乙酯提取物對(duì)煙蚜有較好的防治效果。

本文系統(tǒng)探究了核桃青皮乙酸乙酯提取物不同濃度和不同作用時(shí)間對(duì)煙草蚜蟲的生防作用，結(jié)果表明，核桃青皮乙酸乙酯提取物對(duì)煙蚜具有很好的毒殺作用和拒食活性，這與文獻(xiàn)[8]頗有異曲同工之處，不同的是文獻(xiàn)[8]中采用的是氯仿作為提取溶劑，并且本文研究結(jié)果要明顯優(yōu)于文獻(xiàn)[8]。另外，與梁永鋒等[9]研究相比，本文充分考察了作用時(shí)間和濃度對(duì)防治效果的影響。此外，王宏虬等[10]雖然也考察了核桃青皮不同溶劑提取物對(duì)馬鈴薯蚜蟲的防治作用，但未充分考察乙酸乙酯提取物作用時(shí)間對(duì)馬鈴薯蚜蟲的綜合防治效果。因此，本研究在一定程度上能夠?yàn)闊煵莶∠x害的生物防治提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]STROM B L,SMITH S L,BROWNIE C.Attractant and disruptant semiochemicals for Dendroctonus jeffreyi(Coleoptera：Curculionidae：Scolytinae)[J].Environ mental Entomology,2013,42(2)：323-332.

[2]ALI J G,ALBOM H T,CAMPOS H R,et al.Subterranean,herbivore-induced plant volatile increases biological control activity of multiple beneficial nematode species in distinct habitats[J].PLoS One,2012,7(6)：3814-3816.

[3]張瑞,韋學(xué)義,劉璐,等.青龍衣化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2013(35)：5-7.

[4]LI X F.Progress of research on the chemical components and pharmaceutical action of walnut green husk[J].Food Science and Technology,2007(4)：241-242.

[5]蔣麗萍,劉寶瑞,胡文靜.青龍衣的化學(xué)成分及其抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2014(11)：2735-2737.

[6]王海香,申照靜,杜娟,等.核桃青皮提取物對(duì)朱砂葉螨的毒力及相關(guān)酶活性的測(cè)定[J].林業(yè)科學(xué),2008,44(5)：70-74.

[7]HOSSEINZADEH H,ZAREI H,TAGHIABADI E.Antinociceptive,anti-inflammatory and acute toxicity effects of Juglans regia L.Leaves in mice.[J].Iran ian Red Crescent Medical Journal,2011,13(13)：27-33.

[8]何念武,鳳高峰,黃金輝.核桃青皮氯仿提取物對(duì)煙蚜的防治研究[J].商洛學(xué)院學(xué)報(bào),2017,31(4)：66-70.

[9]梁永峰.核桃青皮提取物對(duì)蘿卜蚜蟲毒殺和拒食活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(2)：187-188.

[10]王宏虬,繆福俊,李彪,等.核桃青皮提取物對(duì)馬鈴薯蚜蟲與瓢蟲的殺蟲活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(7)：112-114.