漢族人群中白介素23受體基因多態性與肺結核易感性的關聯性研究

金鎏 張治國 曹樹輝 王偉 王旭 程建 蘇虹 李傳友

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漢族人群中白介素23受體基因多態性與肺結核易感性的關聯性研究

金鎏 張治國 曹樹輝 王偉 王旭 程建 蘇虹 李傳友

目的 探索白細胞介素23受體(IL-23R)基因多態性在漢族人群中的分布，以及與肺結核患病的關聯。方法 選取2014年3月至2015年12月在首都醫科大學附屬北京胸科醫院所收治的肺結核住院患者作為病例組，共243例；選取北京市昌平區結核病防治所于2014年5—10月進行結核病體檢的健康者作為對照組，共226名。利用NCBI數據庫篩選出9個IL-23R基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(rs3762318、rs11209026、rs10889657、rs10889677、rs6682925、rs1004819、rs11465804、rs2201841、rs7514847)作為待測位點，利用高溫連接酶檢測技術對待測位點進行檢測并做基因分型，比較病例組和對照組等位基因及基因型頻率，分析找出連鎖不平衡和易感單倍型，從而發現該基因多態性與肺結核易感性之間的關系。結果 經過比較分析，IL-23R多態性位點rs6682925最小等位基因C在病例組中頻率為44.0%(213/484)，高于對照組中的37.4%(169/452)，差異有統計學意義[χ2=4.24，P=0.040；OR(95%CI)值：1.32(1.01～1.71)]；基因型 TT在病例組頻率為30.1%(73/242)，低于對照組的38.9%(88/226)，差異有統計學意義[χ2=3.99，P=0.040；OR(95%CI)值：0.68(0.46～0.99)]。rs3762318等位基因C頻率在病例組中為16.0%(78/486)，高于對照組的10.2%(46/450)，差異有統計學意義[χ2=7.04，P<0.01；OR(95%CI)值：1.69(1.14～2.49)]；基因型CC在病例組中頻率為3.3%(8/243)，高于對照組的0.4%(1/225)，差異有統計學意義[χ2=5.02，P=0.040；OR(95%CI)值：7.63(0.95～61.46)]；基因型TT頻率在病例組中為71.5%(173/243)，低于對照組的80.0%(180/225)，差異有統計學意義[χ2=4.89，P=0.030；OR(95%CI)值：0.62(0.40～0.95)]。連鎖分析和單倍型分析中發現由9個目標SNP位點構建的單倍型CTCACTCTG在病例組中期望頻率為5.1%，在對照組中為2.2%，差異有統計學意義[χ2=5.65，P=0.017；OR(95%CI)值：2.44(1.14～5.19)]。結論 IL-23R的rs6682925和rs3762318多態性位點突變在漢族人群中有較高的頻率，且和肺結核患病相關；攜帶由9個目標SNP點位構建的單倍型CTCACTCTG是肺結核的危險因素。

結核，肺； 白細胞介素23； 受體，白細胞介素； 多態性，單核苷酸； 疾病易感性； 病例對照研究

盡管感染結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是導致結核病的必要條件，但大多數感染者卻并未發病，研究表明，僅有10%的感染者會進一步發展為活動性結核病[1]。這就提示我們結核病的發病與個體的免疫狀態相關，而個體免疫狀態的差異與遺傳因素密不可分。機體有效地抵抗MTB感染需要天然免疫和適應性免疫協同完成，白細胞介素-23(interleukin-23，IL-23)在兩者中起到重要的連接作用。IL-23復合物為IL-23 P19和IL-12 P40兩個亞單位組成，分別對應受體IL-23R和IL-12R β1[2-3]。目前研究表明，IL-23為CD4+T細胞的活化、增殖、分化的關鍵細胞因子，IL-23可以誘導CD4+T細胞的增殖，并可以增強樹突狀細胞(dendritic cell，DC)等抗原提呈細胞的活動，直接誘導DC分泌γ干擾素(IFN-γ)和IL-12，從而活化抗原提呈細胞，增強輔助T細胞1(Th1)的活動，進而增強巨噬細胞的吞噬、自然殺傷細胞的殺傷能力，以及組織的炎性反應等作用[4]。近年來，Th17在結核病感染的機制中被關注。有研究表明，Th17通過趨化因子募集中性粒細胞在病灶的聚集并調節由病原體感染而引起的炎性反應，從而促進肉芽腫的形成和維持其完整性[5-7]。如果IL-23及其受體缺失，可導致肺部感染組織嚴重的炎性反應和纖維蛋白的沉積，這可能會導致MTB擴散進而發展為活動性肺結核[8-9]。IL-23R存在于Th17表面，為Th17分化和存活的重要細胞因子；若IL-23缺失，則Th17不能增殖和存活[10-11]。IL-23R基因多態性與結核病發病之間的關聯研究在漢族人群中尚無報道，而我國是結核病高負擔國，結核病疫情嚴峻[12]。本研究對我國漢族人群IL-23R基因9個多態性位點進行分析，以探索IL-23R基因多態性與肺結核易感性之間的關聯。

對象和方法

1.研究對象：選取2014年3月至2015年12月在首都醫科大學附屬北京胸科醫院所收治的肺結核住院患者作為病例組，共243例；選取北京市昌平區結核病防治所于2014年5—10月進行結核病體檢的健康者作為對照組，共226名。兩組研究對象均為漢族且無親屬關系。研究對象的納入通過了首都醫科大學附屬北京胸科醫院及北京市昌平區結核病防治所倫理委員會的審核，并經研究對象知情同意。

樣本量的確定使用NCSS-PASS 11軟件，根據非配對病例-對照研究樣本量計算方法，通過NCBI數據庫給出的人群中標簽單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)的頻率，SNP的頻率取值P0=20%，根據實驗預測結果，在OR=2，α=0.05(雙側)，β=0.1的水平上，通過軟件計算得出病例組和對照組各需樣本數量為230，考慮到實驗成功率并非100%，因此，確定兩組樣本數量均為245。由于實驗過程中造成樣本損失，最終具有有效數據的研究對象為病例組243例，對照組226名。

2.納入標準：(1)病例組：①痰培養檢測呈陽性，同時胸部X線攝片顯示有結核樣病灶；②痰培養陰性，但影像學檢測顯示活動性肺結核征象，且通過抗結核藥物治療好轉，臨床證實為肺結核；③結核菌素試驗(PPD試驗)強陽性，結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測陽性，并伴有明顯肺結核臨床癥狀者；④無糖尿病、惡性腫瘤、HIV感染等免疫功能低下者，無肺炎、塵肺等相似呼吸系統疾病者。(2)對照組：①無結核病史，無糖尿病、惡性腫瘤、HIV感染者；②經PPD檢測、T-SPOT.TB檢測、影像學診斷無MTB感染及活動性結核病者；③無肺結核臨床癥狀，且無肺炎、塵肺等相似病患。

3.實驗器材和試劑：(1)實驗器材：基因組提取采用天根DP318-02血液基因組DNA提取試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)；PCR試驗采用北京東勝創新生物科技有限公司的東勝龍黑金剛EDC-810 PCR儀；用3730XL基因測序儀(美國ABI公司)對PCR產物進行測序；離心機：Allegra 25R臺式高速冷凍離心機(美國Beckman公司)、Micro 17R微量臺式離心機(美國Thermo公司)；微量可調移液器(德國Eppendorf公司)。(2)主要試劑：Taq酶(加拿大Fermentas公司)、dNTP(加拿大Fermentas公司)、Taq DNA ligase(美國NEB公司)。

4.標本收集：采集研究對象肘部靜脈血5 ml，常溫下保存不超過24 h，-80 ℃低溫長期保存。采集的血標本提取完血清后，對剩余血塊進行DNA提取，即將血塊用墊有2層無菌紗布的注射器進行擠壓過濾，再用墊有4層無菌紗布的注射器進一步擠壓過濾[13]。通過該方法處理，可有效過濾掉血塊中的纖維狀成分，血塊充分被打散，血細胞處于游離狀態，并利用全血DNA提取試劑盒進行DNA提取。

5.SNP的選擇和分型：IL-23R基因位于染色體1p31區域，全長298 660 bp。通過NCBI數據庫獲取IL-23R基因的全場序列，并對IL-23R基因的標簽SNP進行檢索。根據對現有SNP的報道為依據，SNP與結核病發病有類似免疫機制的疾病相關聯，且在人群中分布頻率>5%，進行SNP篩選。最終從基因上游2 kb區域、外顯子、內含子中篩選出SNP：rs3762318、rs11209026、rs10889657、rs10889677、rs6682925、rs1004819、rs11465804、rs2201841、rs7514847，作為待檢測多態性位點(表1)。基因分型采用高溫連接酶檢測反應(ligase detection reaction，LDR)，通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)對目標基因片段進行擴增，利用高溫連接酶實現對基因多態性位點的識別(高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補的2條寡聚核苷酸接頭對應處存在著基因點突變類型的堿基錯配，則連接反應就不能進行)，再將所得PCR產物進行測序，判斷目標點位的基因型。

結 果

1.基本情況：研究對象中，病例組有243例，對照組有226名；兩組研究對象年齡、性別、婚姻狀況、文化程度比較差異均無統計學意義，均衡可比(表2)。

表1 所選標簽SNP的信息

注 Chr1：一號染色體；Arg：精氨酸；Gln：谷氨酰胺

表2 不同人口特征在病例組和對照組分布情況的比較

表3 等位基因和基因型在病例組和對照組中分布情況

注 SNP：單核苷酸多態性；MAF：最小等位基因頻率；a：該點位對照組缺失1名研究對象信息；b：該點位病例組缺失1例研究對象信息；表中括號外數值為等位基因或基因型頻次，括號內數值為等位基因或基因型頻率(%)

2.基因多態性與疾病關聯分析：對9個SNP位點的基因型分布分別在病例組和對照組中進行Hardy-Weinberg平衡檢測，發現各基因型均滿足Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。對9個SNP位點進行分型，并計算最小等位基因和基因型頻率(表3)，分別在病例組和對照組之間比較最小等位基因和各基因型分布的差異。通過單因素logistic回歸分析可以看出，rs6682925和rs3762318在病例組和對照組間的分布差異有統計學意義(表4)。

利用SHEsis軟件對該樣本進行了連鎖不平衡分析和單倍型分析，從而確定各位點之間的關聯以及發現是否存在具有疾病風險的單倍型[14]。其中，通過連鎖不平衡分析評估該9個SNP位點是否存在非隨機相關，并給出各點位關聯度D′值和r2值。

表4 rs6682925和rs3762318位點等位基因和基因型在病例組和對照組間分布的比較

注 SNP：單核苷酸多態性；a：該點位病例組缺失1例研究對象信息；b：該點位對照組缺失1名研究對象信息；表中括號外數值為等位基因或基因型頻次，括號內數值為等位基因或基因型頻率(%)

表5 IL-23R多態位點單倍型期望頻率在病例組和對照組間的比較

注 各點位從染色體上游至下游順序依次為rs3762318、rs10889657、rs6682925、rs10889667、rs1004819、rs7517847、rs2201841、rs11465804、rs11209026；a：單倍型頻率分布在病例組或對照組中大于3%

D′值結果顯示各多態性位點普遍存在非隨機相關，以D′≥0.8作為連鎖不平衡強關聯標準，則有13組位點兩兩組合存在強關聯；以r2≥0.8作為連鎖不平衡強關聯標準，r2值顯示rs10889677和rs2201841存在強關聯，r2=0.88。由于各位點間普遍存在連鎖不平衡，因而全部9個SNP位點被納入到單倍型分析中。經分析存在51種單倍型組合，其中，對10種單倍型在組間的分布進行了比較，而其余單倍型頻率由于均小于3%，因而予以排除。經分析，IL-23 R單倍型CTCACTCTG在病例組中的期望頻率為5.1%，明顯高于對照組中的2.2%，差異有統計學意義，攜帶CTCACTCTG單倍型者肺結核患病風險是未攜帶者的2.44倍(表5)。

討 論

IL-23及其受體在機體免疫應答中起到重要的作用。近年來，大量關于IL-23R基因多態性與免疫相關疾病的關聯已被報道。Dong等[15]在中國漢族人群中發現IL-23R多態性位點rs7517847中等位基因G和基因型GG，rs11209032中基因型AA，rs17375018中等位基因T與強直性脊柱炎密切相關；Szabo等[16]在歐洲白人人群中發現IL-23多態性位點rs1343151最小等位基因A,rs10889677中基因型AA是克羅恩病的風險因素；Lee和Song[17]在一項關于IL-23R與牛皮鮮的薈萃分析中發現多態性點rs6687695和rs11209026中的最小等位基因T和A與牛皮鮮發病相關。這不僅揭示了IL-23R多態性在各人群中廣泛分布，而且在免疫相關疾病中起到重要的影響。除了自身免疫性疾病，Zhang等[18]在漢族人群中發現由分枝桿菌感染的麻風病與多態性點位rs3762318存在關聯，其中最小等位基因A是麻風病的保護因素。然而，IL-23R基因多態性與結核病之間的關聯研究卻很少。2013年，Ben-Selma和Boukadida[19]在突尼斯人群中進行了研究，結果表明IL-23R多態性位點rs11209026在該人群中突變頻率很高，最小等位基因A和基因型AA是肺結核的危險因素；而在維吾爾族人群中發現，IL-23R多態性位點rs7518660基因型AA，rs10889677基因型CC在肺結核患者與健康對照者中分布存在明顯差異，并影響IL-23R基因拷貝數[20-22]。而SNP在不同人群中的分布常會出現較大差異，IL-23R多態性與肺結核的關聯研究在漢族人群中尚無報道。

本次研究發現，rs6682925和rs3762318的最小等位基因和最小等位基因純合子在肺結核患者和健康對照者中存在分布差異，其中rs6682925中最小等位基因C為肺結核的風險基因，其在健康人中的基因頻率達37.4%，與先前報道的漢族人群該基因分布基本吻合[23]，印證了該基因在漢族人群中有較高的突變頻率。同時，該突變位點曾被廣泛驗證在惡性腫瘤和冠心病患者中具有較高突變頻率[23-25]，在結核病患者中尚未見報道。在多態性位點rs3762318中，本研究發現攜帶最小等位基因C，突變基因型CC者均有肺結核患病風險，其中最小等位基因C頻率在健康人群中達10.2%，與Zhang等[18]在2011年做的一項關于麻風病的全基因組關聯分析的最小等位基因頻率基本一致。有趣的是，攜帶最小等位基因C是麻風病患病的保護因素，而在本次研究中確定其為肺結核患病的危險因素。該結果不能簡單解釋為由于抽樣造成，雖然結核病與麻風病均由分枝桿菌引起，而發病機制不盡相同，因而該差異需要持續關注。同時，本次研究驗證了多態性位點rs1004819等位基因T雖然在漢族人群中存在較高的突變率，但無論是等位基因還是基因型，均與肺結核患病沒有關聯。該結果與突尼斯進行的肺結核相關性研究的結論存在明顯差異[19]，從而驗證了該位點多態性不是漢族人的肺結核患病的風險基因。江道斌等[22]在中國維吾爾族人群中發現rs10889677位點基因型CC與肺結核的易感性相關(OR=1.53，95%CI：1.01～2.31)；在本次研究中未發現該位點基因型CC與肺結核患病存在相關性，究其原因，可能為抽樣誤差所致，尚待進一步探究。而rs10889677位點T→C突變在漢族人群中普遍存在，最小等位基因頻率為25.4%，應持續關注。

多位點之間的單倍型分析較單個點位的分析具有明顯優勢，以往進行的SNP研究往往忽略了各位點之間的關聯，而當同一基因上多個突變等位基因相互作用，則可構建出一個對疾病表型有更強作用的“超級等位基因”。 Epstein和Satten[26]指出，當疾病是由于同一染色體上多個易感變量的相互作用引發時，單倍型分析能更為有效地找出發病關聯。本次研究通過連鎖不平衡分析確定了各檢測位點之間的關聯度，而單倍型分析發現在IL-23R基因中單倍型CTCACTCTG與肺結核患病相關。

由于我國人群廣泛接種卡介苗，傳統的結核菌素試驗在區分結核分枝桿菌感染者和由于接種卡介苗的健康者存在困難，因而難以將隱性感染者從健康對照中篩出，從而影響研究結果。本研究在健康對照者的選擇上，從1263名體檢人員中選取了PPD陰性，且T-SPOT.TB陰性的226名作為對照組，有效地篩選出無結核隱性感染的健康對照者，從而提高了研究效率。

本研究尚存在一些不足：(1)僅對IL-23R基因內的9個多態性位點進行了檢測。由于IL-23R基因多態性位點眾多，筆者僅通過數據庫篩選了部分標簽位點進行驗證分析。雖然進行了連鎖不平衡和單倍型分析，但與其他未檢測位點是否具有關聯性不得而知。而影響到基因表達往往是多個位點共同參與的結果。(2)本次研究未納入潛伏感染者作為研究對象。IL-23R基因多態性對于健康者感染MTB到潛伏感染者發病的影響則需進一步驗證。(3)未進行基因表達水平的驗證。由于受體存在于細胞膜表面，通過一般的血清學方法無法檢測到IL-23R受體的表達水平，而受制于標本狀態也很難進行細胞流式實驗。因而突變位點的對象中，IL-23R 的表達水平無法得知。(4)在進行統計分析時，考慮到多重校正相對嚴格保守，可能會篩掉一些有意義的位點，由于本次研究位點較少，且各SNP位點均位于同一染色體上，因而本研究統計分析結果未進行多重比較校正。

綜上所述，本次研究發現IL-23R基因rs6682925和rs3762318多態性位點的變異在漢族人群中有較高的頻率，且和肺結核患病相關；單倍型CTCACTCTG是肺結核患病的危險因素。rs10889677在漢族人群中具有較高的突變率，可能與肺結核患病相關，應持續關注。基因與基因間相互關聯則需要進一步探究，而多態性位點rs6682925和rs3762318是否影響到機體IL-23R表達水平也需要進行進一步驗證。

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(本文編輯：李敬文)

Relationship between interleukin-23 receptor gene polymorphisms and susceptibility to pulmonary tuberculosis in Chinese Han population

JINLiu*,ZHANGZhi-guo,CAOShu-hui,WANGWei,WANGXu,CHENGJian,SUHong,LIChuan-you.

*DepartmentofEpidemiologyandBiostatistics,SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230031,China

s:SUHong,Email:suhong5151@sina.com;LIChuan-you,Email:bjjysxjmyslcy@126.com

Objective To investigate distribution of interleukin-23 receptor (IL-23R) polymorphisms in Chinese Han and the relationship between the distribution and pulmonary tuberculosis (PTB). Methods A case-control study was performed, 243 PTB cases were selected as case group hospitalized Beijing Chest Hospital, Capital Medical University during March 2014 to December 2015 and 226 healthy controls were recruited by the tuberculosis physical examination in Beijing Changping Center for tuberculosis control and prevention during May 2014 to October 2014. Nine polymorphic sites (rs3762318,rs11209026,rs10889657,rs10889677,rs6682925,rs1004819,rs11465804,rs2201841,rs7514847) were screened out using NCBI database, single nucleotide polymorphisms (SNPs) were detected by ligase detection reaction (LDR) for genotyping and frequency comparision, linkage analysis and haplotype analysis were performed to find out linkage disequilibrium and haplotype. Through above-mentioned methods, the association between IL-23R SNPs and PTB were estimated. Results There was a significant difference in the distribution of IL-23R gene polymorphism at polymorphic siters6682925 between PTB cases and healthy controls, allele C frequency in cases (44.0% (213/484)) was significantly higher than in controls (37.4% (169/452)) (χ2=4.24,P=0.040;OR=1.32, 95%CI: 1.01-1.71); genotype TT frequency in cases (30.1% (73/242)) was also significantly higher than in controls (38.9% (88/226)) (χ2=3.99,P=0.040;OR=0.68, 95%CI: 0.46-0.99). As to polymorphic siters3762318, allele T frequency in cases (16.0% (78/486)) was significantly higher than in controls (10.2% (46/450)) (χ2=7.04,P<0.01;OR=1.69, 95%CI: 1.14-2.49); genotype CC frequency in cases (3.3% (8/243)) was significantly higher than in controls (0.4% (1/225)) (χ2=5.02,P=0.040;OR=7.63, 95%CI: 0.95-61.46); genotype TT frequency in cases (71.5% (173/243) was significantly higher than in controls (80.0% (180/225)) (χ2=4.89,P=0.030;OR=0.62, 95%CI: 0.40-0.95). Haplotype CTCACTCTG built by nine target SNPs sites in cases was found significantly different from controls by haplotype analysis (5.1% vs. 2.2%,χ2=5.65,P=0.017;OR=2.44, 95%CI: 1.14-5.19). Conclusion Polymorphic sitesrs6682925 andrs3762318 are widely existed among Chinese Han population and these two SNPs are susceptible to PTB. Haplotype CTCACTCTG built by the nine SNPs sites is a risk factor for susceptibility to PTB in Chinese Han population.

Tuberculosis, pulmonary; Interleukin-23; Receptors, interleukin; Polymorphism, single nucleotide; Disease susceptibility; Case-control studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.05.017

230031 合肥，安徽醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計系(金鎏、王旭、程建、蘇虹)；北京市昌平區結核病防治所(張治國)；首都醫科大學附屬北京胸科醫院 北京市結核病胸部腫瘤研究所細菌免疫研究室(曹樹輝、王偉、李傳友)

蘇虹，Email：suhong5151@sina.com；李傳友，Email：bjjysxjmyslcy@126.com

2016-12-26)