黃芪藥材不同提取部位增強免疫力的藥效學研究

洪 妍， 劉小花， 陳亞麗， 王 波,2，徐紅坤， 吳志華， 閔云霞， 封士蘭

(1.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省出入境檢驗檢疫局 綜合技術中心，甘肅 蘭州 730000)

黃芪藥材不同提取部位增強免疫力的藥效學研究

洪 妍1， 劉小花1， 陳亞麗1， 王 波1,2，徐紅坤1， 吳志華1， 閔云霞1， 封士蘭1

(1.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省出入境檢驗檢疫局 綜合技術中心，甘肅 蘭州 730000)

比較研究了黃芪藥材不同提取部位對小鼠免疫調節(jié)作用的藥理活性.灌胃給予正常小鼠和免疫抑制小鼠黃芪的不同提取部位，檢測了小鼠的吞噬指數、遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)程度、外周白細胞總數、臟器指數及干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素- 4(IL- 4)的水平.實驗結果表明：黃芪水煎煮部位和小分子部位能顯著提高正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫功能(P<0.01；P<0.05)；10批黃芪藥材小分子部位均能明顯提高免疫抑制小鼠的吞噬指數和DTH程度(P<0.01；P<0.05)；某些產地樣品能顯著提高免疫抑制小鼠的臟器指數及IFN-γ，IL- 4的水平(P<0.01；P<0.05)，表明黃芪藥材的產地與免疫調節(jié)作用密切相關.

免疫調節(jié)；黃芪藥材；吞噬指數；遲發(fā)型變態(tài)反應

黃芪在免疫調節(jié)方面有著非常悠久的用藥歷史.《黃帝內經》中提出“正氣存內，邪不可干”，其中的“正氣”即為現代醫(yī)學所說的免疫力[1].《本草綱目》中稱黃芪為“補者之長”，“可治一切氣衰血虛之癥”.現代藥理學研究證實[2]，黃芪可顯著增強機體免疫力，提高癌癥患者的生存質量.

本實驗室前期研究獲得了黃芪95%乙醇提取物的5個不同的提取部位，并進行了小鼠碳廓清實驗[3]，結果顯示其中水提取部位具有增強小鼠免疫力的作用.結合中醫(yī)臨床黃芪用藥療效部位，其水煎煮提取生產工藝簡單、成本低廉，提示黃芪水煎液提高機體免疫功能的藥效成分可能來源于小分子物質.據此，本實驗采用水煎煮提取工藝得到了黃芪水煎液，并通過乙醇沉淀得到其上清小分子部位和醇沉部位.本文探討了所獲得的黃芪不同提取部位對正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫調節(jié)作用，篩選出黃芪提高免疫力的較優(yōu)部位；進而，對黃芪藥材的較優(yōu)藥效部位進行了多指標(吞噬指數、遲發(fā)型變態(tài)反應程度、外周白細胞總數、細胞因子及臟器指數)測定分析，綜合評價篩選出黃芪藥材提高免疫力的最優(yōu)部位；最后，研究了不同產地黃芪藥材最優(yōu)部位的免疫調節(jié)作用，以期說明黃芪產地與藥性的關系.

1 儀器與材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性昆明種小鼠，體質量為18～22 g，由蘭州大學動物實驗中心提供，合格證號 SCXK(甘)2013- 0002.給藥前一周進行適應性飼養(yǎng)，自由進食進水.

1.2 藥材與試劑

10批黃芪藥材，2015年購買或采自全國產地種植或野生黃芪，經蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定均為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao，編號及來源見表1.

注射用環(huán)磷酰胺(安道生，德國百特公司，批號為5K084A)；印度墨汁(西安羅森伯科技有限公司)；2,4- 二硝基氟苯(DNFB，麥克林股份有限公司)；硫化鈉(天津市巴斯夫有限公司)；芝麻油(上海太太樂食品有限公司)；小鼠IFN-γ,IL- 4 ELISA試劑盒(欣博盛生物科技公司，批號均為160729).

表1 黃芪藥材的來源

1.3 主要儀器

CR22GII,HITACHI離心機(日本株式會社日立制作社)；Z36HK超高速冷凍離心機(德國賀默儀器科技有限公司)；Freezone 6PWS型真空冷凍干燥儀(美國Labconco公司)；UV- 1700 紫外分光檢測儀(日本島津公司)；BC- 5390 CRP全自動血細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司)；550酶聯免疫檢測儀(美國Bio- Rad 公司).

2 實驗方法

2.1 樣品制備

稱取已粉碎的黃芪藥材(產自內蒙古銀號) 500 g，按文獻[3]方法提取，濃縮得到水提取部位.

稱取1 kg黃芪藥材，依次用10倍量水煎煮2 h，8倍量水煎煮1.5 h及6倍量水煎煮1 h，合并水煎液，過濾，取其中1/2濃縮至干，即得水煎煮部分；剩余1/2濃縮后加乙醇使其最終體積分數為70%，靜置沉淀過夜后離心，上清液濃縮至干得到小分子部分，沉淀真空冷凍干燥得醇沉部分.根據各部分的出膏率換算出小鼠的給藥劑量.

2.2 黃芪不同提取部位對正常小鼠免疫功能的作用

將100只小鼠隨機分成免疫Ⅰ組和Ⅱ組兩大組，Ⅰ組進行碳廓清實驗，Ⅱ組進行遲發(fā)型變態(tài)實驗及胸腺、脾臟指數測定.每大組下設5個小組，分別為空白對照組和4個不同部位的給藥組，每組10只小鼠.空白對照組給予生理鹽水，各給藥組按原生藥5.0 g·kg-1的劑量換算后給予黃芪提取物.連續(xù)給藥4周后測定各項指標.

2.3 黃芪不同提取部位對免疫抑制小鼠免疫功能的作用

將240只小鼠隨機分成免疫 Ⅰ 組、Ⅱ組和Ⅲ組三大組，Ⅰ組、Ⅱ組測定指標同上，Ⅲ組測定外周血白細胞數.每大組下設8個小組，分別為空白對照組、模型對照組及水煎煮、小分子和醇沉部分的高、低劑量組，每組10只小鼠.空白對照組和模型對照組給予生理鹽水，給藥組按原生藥5.0 g/kg(低劑量)和10.0 g/kg(高劑量)換算后給藥.灌胃4周，在第3周后，除空白對照組外其余各組小鼠連續(xù)2 d腹腔注射55 mg·kg-1新鮮配制的環(huán)磷酰胺.造模后第5天測定各項指標.

2.4 10批黃芪藥材小分子組對免疫抑制小鼠免疫功能的作用

將360只小鼠隨機分成Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組三大組，Ⅰ組、Ⅱ組測定指標同上，Ⅲ組測定細胞因子IFN-γ和IL- 4的水平.每大組下設12個小組，分別為空白對照組、模型對照組和10批黃芪小分子高劑量組.空白對照組和模型對照組均給予生理鹽水，給藥組按原生藥10.0 g·kg-1的劑量換算后給藥.其余操作同上.

2.5 各項指標的測定方法

2.5.1 碳廓清實驗

小鼠尾靜脈注射用生理鹽水1∶3稀釋的印度墨汁10 mL·kg-1，于注射后2 min和10 min從眼眶后靜脈叢取血40 μL，加入4 mL 0.1%Na2CO3溶液中，充分混勻后在600 nm波長下測定吸光度值，以0.1%Na2CO3溶液為空白.小鼠處死后，稱量其肝臟和脾臟的質量，按文獻[4]的

方法計算其吞噬指數α.

2.5.2 遲發(fā)型變態(tài)反應實驗

本實驗采用耳腫脹法測定小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應程度.小鼠腹部用8%Na2S溶液脫毛后，吸取10 mg·mL-1DNFB丙酮麻油(1∶1)溶液50 μL，均勻涂于其腹部.5 d后，將10 μL DNFB溶液涂抹于小鼠右耳兩側，24 h后處死小鼠，在其左右耳取下直徑為0.8 cm的耳片，按文獻[4]的方法計算，以左右耳質量差值反映小鼠的DTH程度.

2.5.3 臟器指數測定

取小鼠的胸腺和脾臟，稱量胸腺、脾臟的質量及體質量，計算胸腺指數和脾臟指數.

2.5.4 外周白細胞總數測定

小鼠眼眶后靜脈叢取血，加入稀釋液中，于全血細胞分析儀中檢測.

2.5.5 細胞因子測定

收集小鼠血漿，將血漿標本按1∶2加入標本通用稀釋液稀釋后，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，于450 nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線計算IFN-γ和IL- 4的含量.

2.6 統計學處理

3 實驗結果

3.1 黃芪不同提取部位對正常小鼠免疫功能的作用

從表2可知：與空白對照組相比，黃芪小分子組的吞噬指數和脾臟指數均呈顯著性差異(P<0.05)；水煎煮組與空白對照組相比，除胸腺指數無顯著性差異外，其余各項指標均呈現顯著性差異(P<0.05；P<0.01)；水提取部位與空白對照組相比，僅脾臟指數呈現顯著性差異(P<0.01)；醇沉組僅胸腺指數呈顯著性差異(P<0.05).由此可見，黃芪小分子組和水煎煮組較水提取部位組在改善免疫指標方面有明顯的優(yōu)勢.

表2 黃芪不同提取部位對正常小鼠免疫功能的影響

注：與空白對照組相比，##表示P<0.01；#表示P<0.05.

3.2 黃芪不同提取部位對免疫抑制小鼠免疫功能的作用

為了進一步篩選出提高小鼠免疫力的最優(yōu)藥效部位，本實驗探討了黃芪不同提取部位2個劑量組對免疫抑制小鼠免疫功能的作用，結果見表3.與空白對照組相比，模型對照組的5項指標均有極顯著性差異(P<0.01)，說明小鼠免疫抑制模型制備成功.與模型對照組相比，小分子低劑量組的吞噬指數、胸腺指數和脾臟指數均有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)；高劑量組的吞噬指數、DTH程度及胸腺指數均有極顯著性差異(P<0.01).與模型對照組相比，黃芪水煎煮低劑量組僅DTH程度具有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組的吞噬指數、DTH程度及脾臟指數均具有顯著性差異(P<0.01；P<0.05).與模型對照組相比，醇沉低劑量組的吞噬指數和外周白細胞總數均有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)；高劑量組的吞噬指數和脾臟指數有極顯著性差異(P<0.01).說明其作用存在一定的劑量效應關系.

因為吞噬指數、DTH程度及外周白細胞總數是評價免疫功能的主要指標，綜合正常小鼠及免疫抑制小鼠的藥效學數據，可以看出，黃芪水煎煮部位和小分子部位提高小鼠免疫功能的劑量效應關系較為顯著.據此，本實驗選用高劑量小分子組進行不同產地黃芪藥材的免疫藥效學實驗.

表3 黃芪不同提取部位對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

注：與空白對照組相比，##表示P<0.01.與模型對照組相比，**表示P<0.01；*表示P<0.05.

表4 10批黃芪藥材小分子組對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

注：與空白對照組相比，##表示P<0.01；#表示P<0.05.與模型對照組相比，**表示P<0.01；*表示P<0.05.

3.3 10批黃芪藥材小分子組對免疫抑制小鼠免疫功能的作用

不同產地黃芪的免疫調節(jié)作用實驗結果見表4.由表4可知:模型對照組與空白對照組相比均有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)，說明小鼠免疫抑制模型制備成功；與模型對照組相比，10批黃芪藥材的吞噬指數和DTH程度均明顯增加(P<0.01；P<0.05)；與模型對照組相比，僅樣品1和樣品6的胸腺指數有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)，脾臟指數除樣品9和樣品10外均有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)；細胞因子方面，與模型對照組相比，樣品1,2,4,5,8和10的IFN-γ含量有顯著性差異(P<0.01；P<0.05)，樣品1,2,5和10的IL- 4含量有顯著性差異(P<0.01；P<0.05).10批不同產地的黃芪藥材均能在不同程度上提高免疫抑制小鼠的免疫功能，山西渾源、甘肅蓮峰、甘肅雙泉及陜西渭南4個產地的黃芪藥材提高免疫功能的作用更為突出，說明黃芪藥材產地與免疫活性有著密切的關系.

4 討 論

本實驗采用腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法建立免疫抑制小鼠模型.環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)作為一種細胞毒性化療藥物，主要通過干擾癌細胞核酸代謝促使癌細胞凋亡的發(fā)揮作用，是制備免疫抑制模型的一種常用藥物[5- 6].有文獻報道，連續(xù)注射40 mg·kg-1CTX制備免疫抑制模型特異性較差[7].結合《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》[4]的造模方式，本實驗室比較了腹腔注射幾種不同劑量CTX的造模情況，連續(xù)2 d腹腔注射55 mg·kg-1CTX，5 d后測定各項免疫學指標，模型對照組與空白對照組相比有極顯著性差異，確定為最終的造模方式.本實驗采用正常小鼠和免疫抑制小鼠2種方案，分別對黃芪不同提取部位進行了多指標測定分析，綜合評價了黃芪不同提取部位對小鼠的免疫藥效作用.

黃芪水煎液中除含有黃芪多糖等免疫活性較強的大分子化合物外[8]，還含有黃酮及皂苷類成分，這些小分子物質也具有很強的免疫調節(jié)活性.其中，總黃酮可以提高免疫抑制小鼠的CD4+T淋巴細胞水平，升高CD4+/CD8+比值及血清中IFN-γ的水平[9].總皂苷能增強小鼠腹腔巨噬細胞的免疫作用，可能與其引起Ca2+濃度升高從而激活巨噬細胞發(fā)揮免疫作用有關[10].由表2和表3可以看出，黃芪水煎煮組和小分子組均能顯著提高小鼠免疫功能，在所測定的幾項主要指標中，二者顯著性基本一致，說明小分子組基本可以代表黃芪水煎煮組的免疫活性.由于水煎液中醇沉部分提高免疫力效果并不明顯，說明醇沉部分在黃芪水煎液中提高免疫力的作用可忽略不計.因此，本實驗選擇黃芪小分子組進行10批不同產地黃芪藥材的免疫藥效學研究.

本研究結果顯示，10批黃芪藥材小分子組可明顯提高小鼠的免疫功能.以吞噬指數、DTH程度和細胞因子含量作為主要指標，結合胸腺指數和脾臟指數，可以看出，山西渾源、甘肅蓮峰、甘肅雙泉及陜西渭南4個黃芪的給藥組小鼠與免疫抑制小鼠相比，其免疫學藥效指標均有明顯提高，說明黃芪藥材的產地與免疫藥效作用有著密切的關系.后續(xù)研究中，可將所得藥效學數據與黃芪小分子組指紋圖譜進行關聯，多方面綜合評價黃芪藥材質量與免疫藥效學之間的關系，揭示道地藥材優(yōu)質性的科學內涵，為進一步開發(fā)利用黃芪提供堅實的出發(fā)點.

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(責任編輯 薛 榮)

Pharmacodynamical study about immunoenhancement effect of RadixAstragalion mice

HONG Yan1, LIU Xiaohua1, CHEN Yali1, WANG Bo1,2,XU Hongkun1, WU Zhihua1, MIN Yunxia1, FENG Shilan1

(1.CollegeofPharmacy,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China; 2.GansuEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauCentralLaboratoryofTechnicalCenter,Lanzhou730000,China)

Different RadixAstragaliextracts on immunomodulatory effect of pharmacological activities were compared. After oral administration of different RadixAstragaliextracts on normal and immunosuppressed mice, phagocytic index, delayed type hypersensitivity (DTH) degree, leukocyte count, organs index and the level of cytokines IFN-γ, IL- 4 (ELISAs) were investigated four weeks later. By the comprehensive comparison of different extracts, it was found that high dose of water decoction and supernatant extracts both significantly improved immunological function on normal and immunosuppressed mice (P<0.01;P<0.05); 10 batch of RadixAstragalisupernatant extracts significantly improved phagocytic index, DTH degree (P<0.01;P<0.05), and some samples significantly improved organs index and the level of cytokines IFN-γ, IL- 4 (P<0.01;P<0.05) on immunosuppressed mice.The source of RadixAstragalisupernatant extracts was found closely related to the immunomodulatory effect.

immunomodulatory effect; RadixAstragali; phagocytic index; delayed type hypersensitivity

10.16218/j.issn.1001- 5051.2017.02.013

2016- 12- 09；

2017- 02- 23

甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室培育基地開放基金資助項目(ZYZL16- 007)；甘肅省科技計劃資助項目(1506RJZA316)；蘭州市城關區(qū)科技計劃項目(2016- 1- 5)

洪 妍(1991-)，女，甘肅蘭州人，碩士研究生.研究方向：中藥化學成分及藥理學.

封士蘭.E- mail： fengshl@lzu.edu.cn

R285.5

A

1001- 5051(2017)02- 0201- 05