免疫方式對Iss抗體產生的影響

樊琛+徐旺燁+曾慶華+王會+鄭煥芹

摘要：為獲得抗大腸桿菌Iss蛋白的抗體，將純化的GST-Iss蛋白分別免疫雛雞及小鼠。結果顯示，無免疫佐劑、弗氏佐劑免疫雛雞所產生的Iss抗血清效價僅為1∶100，氫氧化鋁佐劑免疫小鼠所產生的Iss抗血清效價為1∶60 000。Iss融合蛋白采用氫氧化鋁佐劑免疫小鼠，可獲得更強的體液免疫應答，抗體效價更高。

關鍵詞：Iss抗體；免疫佐劑；免疫動物

中圖分類號：S852.4+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1307-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.027

The Influence of Immune Methods on Iss Antibody

FAN Chen1，XU Wang-ye2，ZENG Qing-hua1，WANG Hui1，ZHENG Huan-qin1

（1.Agricultural College，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China；

2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Abstract： In order to obtain the antibody against the Iss protein of E. coli，the purified GST-Iss protein was immunized to chicken and mouse respectively. The results showed that Iss antiserum titer of the immune adjuvant-free，Freund's adjuvant immunized chicken was just 1∶100，the aluminum hydroxide adjuvant immunized mice generated Iss titer of antiserum to 1∶60 000. The Iss fusion protein using aluminum hydroxide adjuvant immunized mice can obtain stronger humoral immune responses，antibody titer was higher.

Key words： Iss antibody； immune adjuvant； immune animal

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常稱為大腸桿菌，屬于腸道桿菌中的一種，當飼養(yǎng)環(huán)境差，通風不好，營養(yǎng)缺乏或應激等情況出現會誘發(fā)大腸桿菌病，為人獸共患且危害食品安全[1-3]。進入血流是細菌發(fā)揮其致病作用的關鍵一步，在條件適合時E. coli從肺泡毛細血管進入血循環(huán)，引起菌血癥，從而在全身組織內增殖，當機體抵抗力降低時，E. coli大量繁殖引起敗血癥。一旦病原體獲得到血流的通路，它將面對血清的抑菌作用和殺菌作用[4，5]。Iss蛋白為大腸桿菌毒力島的iss基因（increased serum survival gene）所編碼的外膜蛋白，可增強大腸桿菌在血清中的存活能力，是大腸桿菌的重要毒力因子之一[6]。本試驗以Iss融合蛋白為抗原，探討免疫動物與免疫佐劑對Iss抗體產生水平的影響。

1 材料與方法

1.1 抗原

GST-Iss融合蛋白由聊城大學食品安全教研室進行分離純化，溶解于PBS溶液中，其濃度為1.3 mg/mL。

1.2 試驗動物

1日齡SPF雛雞購于聊城陽谷；4～6周齡小鼠為東北農業(yè)大學動物醫(yī)學院飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑

碳酸鈉、碳酸氫鈉購自Biotopped公司；兔抗雞gY++（IgG）（H+IL）購自Abcam；TMB染色液購自Beyotime Biotechnology；脫脂奶粉購自伊利乳業(yè)有限責任公司。

1.4 抗血清的制備

1）雞-無免疫佐劑。將1日齡SPF雛雞飼養(yǎng)14 d，分為空白、對照、試驗3組。空白組10只，不注射；對照組10只，肌肉注射PBS溶液100 μL/只；試驗組10只，肌肉注射融合蛋白100 μL/只（100 μg/只）。對照組及試驗組每隔一周免疫一次，并取血直到四免，四免后5 d取血。

2）雞-弗氏佐劑。取兩支滅過菌的管，分別標記對照組、試驗組。對照組等量加入PBS溶液、弗氏佐劑，試驗組等量加入融合蛋白、弗氏佐劑，乳化[7]。將1日齡SPF雛雞飼養(yǎng)14 d，分為空白、對照、試驗3組。空白組10只，不注射；對照組10只，肌肉注射PBS溶液200 μL/只；試驗組10只，肌肉注射融合蛋白200 μL/只（100 μg/只）。對照組及試驗組每隔一周免疫一次，并取血直到四免，四免后5 d取血。一免佐劑為完全弗氏佐劑，二免后為不完全弗氏佐劑。

3）小鼠-氫氧化鋁佐劑。對照組等量加入PBS溶液、氫氧化鋁佐劑，試驗組等量加入融合蛋白、氫氧化鋁佐劑，乳化[7]。4～6周齡小鼠每7 d免疫一次，連免4次，腹腔100 μL，頸后皮下、腹股溝皮下各50 μL，四免后加強腹腔100 μL，加強免后3 d眼球采血制血清。

1.5 間接ELISA檢測抗體效價

0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原稀釋至蛋白質含量為10 μg/mL。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 mL，4 ℃過夜。次日，棄去孔內溶液，洗滌3次。加倍比稀釋的待檢樣品及1∶100稀釋的陰性血清0.1 mL于上述反應孔中，37 ℃孵育1 h。加入1∶2 000酶標抗體0.1 mL，37 ℃孵育1 h，洗滌。加入TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃ 30 min。各反應孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL，于450 nm處以空白調零后測各孔OD值。計算P/N≥2.1時的最高稀釋度作為抗體效價[8]。

2 結果與分析

將Iss融合蛋白無免疫佐劑按常規(guī)程序肌肉注射免疫雛雞，四免后取血經間接ELISA檢測，抗血清效價為1∶100；Iss融合蛋白加入弗氏佐劑，按常規(guī)程序肌肉注射免疫雛雞所產生的Iss抗血清，與無免疫佐劑時相近。Iss融合蛋白加入氫氧化鋁佐劑按常規(guī)程序免疫小鼠所產生的Iss抗血清效價為 1∶60 000，具體見表1。從表1可以看出，3種免疫方式所用的Iss融合蛋白免疫量相同，免疫佐劑及免疫動物有差異。在對雛雞進行免疫時，弗氏佐劑組與無免疫佐劑組的效價一樣，弗氏佐劑未能明顯提高Iss抗體效價。采用氫氧化鋁佐劑對小鼠進行免疫時，Iss抗體效價達到1∶60 000，抗體效價明顯提高。

李榮貞等[8]通過對比酶聯免疫法與小鼠血清中和試驗法所測定的破傷風抗體效價，發(fā)現酶聯免疫法與中和試驗法所測得的破傷風抗體效價結果相關性高，酶聯免疫法測得實驗數據RSD<10%，表明酶聯免疫法真實可靠。侯偉杰等[7]以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性表皮葡萄球菌及產色葡萄球菌，經甲醛37 ℃滅活，分別與鋁膠鹽、蜂膠和轉移因子混合制備鋁膠鹽佐劑疫苗、蜂膠佐劑疫苗和轉移因子佐劑疫苗，結果顯示，鋁膠鹽佐劑疫苗刺激機體產生的抗體水平在3個免疫組中最高。韓露等[9]用磷酸鋁（AP）、不同濃度磷酸鹽處理的氫氧化鋁（PTAH）以及氫氧化鋁（AH）佐劑吸附百白破抗原，檢測不同佐劑對各抗原的吸附率；制備不同佐劑類型和吸附率的制劑腹腔免疫NIH小鼠，ELISA法測定免疫后各組小鼠血清抗體滴度，結果表明，鋁佐劑吸附力不影響抗原免疫原性。鄧中華等[10]探討鋁佐劑對HBoV1 VP2 VLPs誘導小鼠免疫應答的影響，加明礬佐劑肌肉注射免疫，結果顯示，明礬佐劑使HBoV1 VP2 VLPs誘導的體液免疫反應增強而細胞免疫反應減弱。

3 小結

在本試驗中，分別采用雛雞與小鼠作為試驗動物，氫氧化鋁、弗氏佐劑為免疫佐劑。結果顯示，加入氫氧化鋁佐劑免疫小鼠，可獲得較強的體液免疫應答，抗體效價較高。試驗僅探討了免疫佐劑及免疫動物對抗體產生水平的影響，后續(xù)試驗可繼續(xù)以小鼠作為試驗動物、氫氧化鋁為佐劑，探討免疫劑量、免疫途徑等因素對抗體水平的影響。

參考文獻：

[1] NOLAN L K，WOOLEY R E， GIDDINGS C W，et al. Characterization of an avirulent mutant of a virulent avian Escherichia coli isolate[J].Avian Diseases，1994，38（1）：146-150.

[2] CHUBA P J，LEON M A，BANERJEE A，et al. Cloning and DNA sequence of plasmid determinant iss，coding for increased serum survival and surface exclusion，which has homology with lambda DNA[J].Molecular & General Genetics，1989，216（2-3）：287-292.

[3] JOHNSON T J，SUBH ASHINIE K，YVONNE W，et al. The genome sequence of avian pathogenic Escherichia coli strain O1∶K1∶H7 shares strong similarities with human extraintestinal pathogenic E. coli genomes[J].J Bacteriol，2007，189（8）：3228-3236.

[4] 樊 琛，劉桂芹，王亞君，等.Iss蛋白在雞源大腸桿菌不同毒力菌株中的檢測[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，4（2）：10-13.

[5] BORST L B，M MITSU S，SHIVARAMU K，et al. A chicken embryo lethality assay for pathogenic Enterococcus cecorum[J].Avian Diseases，2014，58（2）：244-248.

[6] 樊 琛，徐旺燁，李丹丹，等.PCR方法檢測大腸桿菌iss基因的缺陷及改進[J].江蘇農業(yè)科學，2015，43（11）：69-70.

[7] 侯偉杰，高 洋，高晶暉.三種佐劑對奶山羊乳房炎滅活疫苗免疫效果的影響[J].動物醫(yī)學進展，2015，36（1）：45-48.

[8] 李榮貞，趙 軍，李慶英.酶聯免疫法與中和實驗法檢測破傷風抗體效價[J].藥學研究，2015，34（7）：381-383.

[9] 韓 露，邵忠琦，司偉雪.鋁佐劑類型及吸附率對吸附無細胞百白破聯合疫苗免疫原性的影響[J].免疫學雜志，2015，31（7）：580-584.

[10] 鄧中華，段招軍，謝志萍.鋁佐劑對HBoV1 VP2 VLPs誘導小鼠免疫應答的影響[J].中國免疫學雜志，2016，32（1）：56-58，64.