氨磷汀對人巨核細胞白血病Dami細胞促分化作用的機制研究

遲小華，王海英，楊 波，田歡歡，蔡力力，劉 萃，盧學春，童衛杭（.解放軍火箭軍總醫院藥劑科，北京 00800；

2.深圳市中醫院口腔科，廣州 深圳 518033；3.解放軍總醫院南樓血液科，北京 100853；4.解放軍總醫院南樓臨檢科，北京 100853；5.解放軍總醫院南樓超聲科，北京 100853）

·實驗研究·

氨磷汀對人巨核細胞白血病Dami細胞促分化作用的機制研究

遲小華1，王海英2，楊 波3，田歡歡1，蔡力力4，劉 萃5，盧學春3，童衛杭1（1.解放軍火箭軍總醫院藥劑科，北京 100800；

2.深圳市中醫院口腔科，廣州 深圳 518033；3.解放軍總醫院南樓血液科，北京 100853；4.解放軍總醫院南樓臨檢科，北京 100853；5.解放軍總醫院南樓超聲科，北京 100853）

目的：探索氨磷汀對人巨核細胞白血病Dami細胞的促分化作用的機制。方法：采用氨磷汀1 mmol·L-1刺激人巨核細胞白血病Dami細胞系，共誘導12 d，利用RT-PCR及Western blot方法檢測在誘導的0、4 d、8 d、12 d時巨核細胞分化相關轉錄因子GATA-1、NF-E2的表達變化，并通過對Dami細胞進行核質分離以及利用免疫熒光的方法研究兩種轉錄因子在核質中的分布。結果：RT-PCR及Western blot沒有檢測到巨核細胞分化相關轉錄因子GATA-1和NF-E2表達水平升高，但入核實驗結果表明轉錄因子NF-E2、GATA-1入核活性增加。結論：氨磷汀誘導Dami細胞向成熟巨核細胞分化是通過增加轉錄因子NFE2、GATA-1入核活性而發揮作用。

氨磷??；Dami細胞；轉錄因子；NF-E2；GATA-1

氨磷汀（amifostine，AMF）是磷酸化的氨基硫醇，近年來在臨床上廣泛地被應用于癌癥的輔助治療，作為一個廣譜的細胞保護劑特異性保護正常組織[1-2]。血小板減少是臨床上骨髓增生異常綜合征（MDS）和特發性血小板減少性紫癜（ITP）等疾病的主要癥狀之一。血小板由分化成熟的巨核細胞產生，巨核細胞的分化涉及多個復雜的過程，包括DNA倍體化、血小板特異性顆粒形成、分界膜系統的產生等。巨核細胞成熟及血小板釋放的機制極其復雜并且至今沒有被闡釋清楚。本實驗室之前的研究發現，AMF能誘導人巨核細胞白血病細胞Dami向成熟巨核細胞分化，并得到AMF促進Dami細胞分化的最適濃度為1 mmol·L-1[3]，但其具體的機制仍未闡明。文獻報道缺失轉錄因子NF-E2的小鼠巨核細胞成熟后期發生阻滯。缺乏造血細胞特異性亮氨酸拉鏈轉錄因子p45NF-E2的小鼠最明顯的表型是巨核細胞成熟障礙、血小板嚴重減少。巨核細胞特異性敲除鋅指結構轉錄因子GATA-1的小鼠巨核細胞分化阻滯、血小板嚴重減少。缺失NF-E2導致巨核細胞體積變大，缺失GATA-1導致未成熟的巨核細胞聚集成團[4-5]。因此本研究選擇NF-E2和GATA-1兩個轉錄因子，旨在探究AMF誘導Dami向成熟巨核細胞分化的作用機制，旨為AMF的臨床應用提供更多指導。

1 材料與方法

1.1 試劑

Dami細胞系（美國ATCC公司）；RPMI 1640培養基（美國Hyclone公司）；氨磷汀（大連卓悅美羅有限公司藥業分公司），4℃避光保存，每次使用時用RPMI 1640培養基配制成液體；兔抗人NF-E2抗體（美國Santa Cruz生物技術公司）；RNA Trizol（美國Sigma公司）；反轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；兔抗人GATA-1抗體（美國CST公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/羊抗鼠二抗（北京中杉金橋有限公司）；實時定量PCR試劑SYBR?Green Real Time PCR Master Mix（日本Takara公司）；ECL化學發光檢測系統（美國Cell Signaling公司）。

1.2 主要儀器設備

細胞培養箱（3111型，美國Thermo Scientific公司）；超凈工作臺（BLLIN型，濟南亞龍公司）；普通PCR儀（580BR 7853型，美國BIO-RAD公司）；SDSPAGE電泳儀及轉膜儀（580BR 7853型，美國BIORAD公司）；Real Time PCR儀（IQ5型，美國BIO-RAD公司）；激光共聚焦顯微鏡（Ultra View型，美國Perkin Elmer公司）。

1.3 引物合成

本文所需引物及其序列如表1所示，所有引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 轉錄因子引物序列Tab 1 Primer sequences of transcription factors

1.4 細胞培養及增殖

Dami細胞在含10%加熱滅活的胎牛血清、100 U·mL-1青/鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中呈懸浮生長，在37 ℃，含5% CO2飽和濕度條件下培養，細胞密度達90%時傳代。

1.5 RT-PCR

在氨磷汀處理的0（Control）、4、8、12 d，分別取1×106個細胞，Trizol提取總RNA，取1 μg RNA，反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，使用iCycler thermocycler平臺進行實時定量PCR檢測，溶解溫度設定在64 ℃。與管家基因（GAPDH）相比，計算目的基因相對表達水平，利用Bio-Rad iQ5-standard Edition軟件分析結果。

1.6 Western Blotting

Dami細胞在氨磷汀處理的第0（Control）、4、8、12 d，收集1×106個細胞，加入適量M2 buffer 0 ℃裂解15 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，收集上清總蛋白。提取的細胞總蛋白定量后進行SDS/PAGE跑分離膠（12%），電泳結束后將目的蛋白轉移至nitrocellulose膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別和兔抗人NF-E2、GATA-1及鼠抗人GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，T-BST洗3次，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔/羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，T-BST洗3次，ECL顯色系統暗室顯影檢測目的蛋白。

1.7 免疫熒光檢測NF-E2、GATA-1入核情況

在氨磷汀處理第12天，將細胞甩片后，分別和GATA-1、NF-E2抗體室溫孵育30 min，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗3遍，滴加50 μg·mL-1的DAPI染液，室溫避光5 min；PBS洗3遍后激光共聚焦顯微鏡觀察，LSM Image Browser軟件對圖片進行處理。

1.8 統計學分析

使用SPSS19.0軟件，計量資料用均數±標準差（Mean ± SEM）表示，兩組之間均數比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 氨磷汀處理后Dami細胞轉錄因子的變化

根據本實驗室前期實驗結果，氨磷汀刺激Dami細胞分化的最佳藥物濃度為1 mmol·L-1，處理時間為12 d[3]。巨核細胞成熟的后期階段包括有絲分裂、細胞質成熟和前血小板形成，此過程需要各種轉錄因子協同作用，才能最終成熟并產生血小板。為了研究氨磷汀對轉錄因子表達的影響，我們通過實時定量PCR（Q-PCR）檢測了GATA-1、NF-E2等轉錄因子mRNA的水平。與對照組相比，處理組細胞三種轉錄因子mRNA水平并沒有明顯差異（圖1A，P＞ 0.05）。進一步檢測三種轉錄因子蛋白水平隨時間的變化，發現GATA-1、NF-E2表達量也沒有明顯變化（圖1B）。轉錄因子在總量不變的情況下，其激活和失活也可以調節基因轉錄，進行了入核實驗，分析GATA-1、NF-E2活性的變化。發現在氨磷汀處理的第12天，GATA-1、NF-E2在Dami細胞核內聚集（圖1C），結果表明氨磷汀可通過增加轉錄因子入核來促進Dami細胞分化。

圖1 氨磷汀（1 mmol·L-1）對Dami細胞分化相關轉錄因子GATA-1、NF-E2的影響A – mRNA水平表達的結果，B – 蛋白水平表達的結果，C – 免疫熒光結果Fig 1 The effects of amifostine exposure (1 mmol·L-1) for the indicated numbers of days on the differentiation-related transcription factors GATA-binding factor 1 (GATA-1) and nuclear factor-erythroid 2 (NF-E2) in Dami cellsA – results of mRNA expression，B – results of protein expression，C– results of immunof l uorescence

圖2 Western blotting實驗結果Fig 2 Results of Western blotting experiment

2.2 核質分離實驗

為了進一步確定GATA-1和NF-E2的入核增加，我們隨后進行了核質分離實驗，核質分離后Western blotting實驗結果表明對照組GATA-1和 NF-E2聚集在細胞質，而處理Dami細胞12 d后，GATA-1和NF-E2在細胞核中的聚集明顯增加，細胞質中的聚集并沒有明顯增加，Histone-H3和GAPDH作為內參（圖2）。

3 討論

3.1 巨核細胞分化的調控

血小板產生的速率約為每日1011個，應激情況需求量增加時可增至20倍[6]。因此確保血小板的正常供應對于健康至關重要。產生血小板的巨核細胞的生長成熟調控過程極其復雜，巨核細胞在發育成熟過程中受到巨核細胞集落刺激因子（megakaryocyte colony stimulating factor，MCSF）、促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、IL-6、IL-11、c-Mpl配體等細胞因子的調控，MCSF主要刺激前體巨核細胞的增殖，TPO則刺激巨核細胞的成熟[7]，此外c-Mpl配體是TPO相關的一個糖蛋白，在人和鼠中均可以增加血小板的數目，有文獻[8-9]指出c-Mpl配體會調節巨核細胞分化的整個過程，包括核內有絲分裂和胞質成熟。因此提示氨磷汀誘導Dami細胞分化也有可能是通過c-Mpl配體起作用的。此外，HIF2α（hypoxia-inducible factor 2α）通路和VEGF（vascular endothelial growth factor）通路均參與巨核細胞的生成，鐵離子濃度也影響巨核細胞的分化，缺鐵會增加巨核細胞分化和前血小板形成，在缺鐵大鼠的巨核細胞中，HIF2α蛋白表達增加，體外缺鐵培養的巨核細胞上清中VEGF-A的濃度明顯升高，提示HIF2α蛋白和VEGF-A在巨核細胞成熟過程中具有潛在作用[10]。本研究結果表明轉錄因子NF-E2、GATA-1在巨核細胞分化中發揮重要功能，在轉錄水平闡釋了巨核細胞分化的機制。

3.2 氨磷汀的新見解

AMF在人表皮成纖維細胞中能夠保護細胞不受放化療藥物的損傷并且促進斷裂DNA雙鏈的修復，而在乳腺癌MCF7細胞中卻會阻抑DNA的修復[11]，但它選擇性抑制斷裂DNA修復的具體機制還有待研究。這種兩面性使AMF成為目前臨床批準使用的唯一一個符合殺死腫瘤細胞而不損傷正常組織的標準的放射防護劑[12-13]。AMF還能夠預防鉑類化療藥物引起的兒童聽力減退[14-16]。乳腺切除的女性使用AMF能夠保護擴張的軟組織免受輻射誘導的病理性血管增生，保持血管數量接近正常組織，并顯著減少并發癥[1]，但它誘導細胞分化作用最近才被發現，其作用機理更是鮮有報道。本實驗室發現AMF誘導Dami細胞向巨核細胞分化的作用后進一步探究了這一過程的發生機制，AMF誘導Dami細胞向成熟巨核細胞分化是通過增加轉錄因子NF-E2、GATA-1入核活性而發揮作用，使得人們過往對于AMF的認識有了一個全新的見解，也擴大了該藥物的臨床應用范圍。

3.3 GATA-1、Fli-1、NF-E2等轉錄因子在巨核細胞分化過程中的作用

氟波酯（PMA）和TPO能誘導K562細胞[7]和Dami細胞[17]向巨核細胞分化，在誘導Dami分化過程中，GATA-1、Fli-1、NF-E2等轉錄因子蛋白表達水平升高。其中Fli-1對巨核細胞有絲分裂及細胞質成熟起作用，NF-E2（包括兩個剪切體aNF-E2和fNF-E2）對前血小板形成起作用，而GATA-1對上述三個過程均有重要作用[16-19]。我們最初推測AMF增加上述轉錄因子表達來促進Dami細胞分化，但Q-PCR和Western blot未見GATA-1、Fli-1、NF-E2表達水平增高。我們用入核實驗檢測了轉錄因子GATA-1和NF-E2的活性，發現AMF能激活GATA-1和NF-E2入核。這說明AMF通過改變轉錄因子的活性而不是表達量來誘導Dami細胞分化，即AMF能直接或者間接激活轉錄因子，這一發現有助于全面理解AMF的生物學功能。

綜上所述，本研究結果表明AMF能誘導Dami細胞分化，并發現AMF誘導Dami細胞的分化作用和轉錄因子GATA-1和NF-E2的活性相關，這些結果擴展了我們對于血小板減少癥的認識，從而對MDS和ITP等存在巨核細胞分化障礙的疾病治療提供指導。但因為有研究者發現少量的AMF能成功進入腫瘤細胞[11]，所以AMF發揮作用的是它本身還是其活性代謝物WR-1065仍有待確定。AMF促進巨核細胞分化的作用機制還需要在更多的細胞系及動物模型體內研究加以證實。新的分子遺傳學、基因組學和其他方法的迅速發展為藥物機制的進一步研究提供了新的方向。

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Mechanism research of amifostine on inducing the differentiation of human megakaryoblastic leukemia Dami cell line

CHI Xiao-hua1, WANG Hai-ying2, YANG Bo3, TIAN Huan-huan1, CAI Li-li4, LIU Cui5, LU Xue-chun3, TONG Wei-hang1
(1. Department of Pharmacy, General Hospital of Chinese PLA Rocket Force, Beijing 100800, China; 2. Department of Stomatology, Shenzhen Hospital of TCM, Shenzhen 518033, China; 3. Department of Nanlou Hematology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 4. Department of Nanlou Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 5. Department of Nanlou Ultrasonics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective: To explore the mechanism of amifostine on inducing the differentiation of human megakaryoblastic leukemia Dami cell line. Methods: The human megakaryoblastic leukemia Dami cell line were exposed to amifostine (1 mmol·L-1) for 12 days. At different time points (0、4 d、8 d、12 d), the expression of megakaryocytic differentiation-associated transcription factors such as GATA-binding factor 1 (GATA-1) and nuclear factor erythroid 2 (NF-E2) were detected by RT-PCR and Western blot. Then in order to measure the distribution of the two transcription factors in nucleoplasm, nuclear and cytoplasmic were isolated, and immunofluorescence was used. Results: There was no elevation on the mRNA or protein levels of megakaryocytic differentiationassociated transcription factors GATA-1 and NF-E2 by RT-PCR and Western blot, but nuclear import assay revealed an increased nuclear translocation activity of GATA-1 and NF-E2. Conclusion: Amifostine induced the differentiation of Dami cells into mature megakaryocytes via the mechanism involving increased nuclear translocation activity of the transcription factors GATA-1 and NF-E2.

R979.1

A

1672 – 8157(2017)01 – 0019 –04

國家自然科學基金項目（81302801，81273597）；解放軍總醫院科技創新苗圃基金項目（15KMM21）；解放軍總醫院臨床科研扶持基金項目（2016FC-ZHCG-1004）

童衛杭，男，主任藥師，研究方向：臨床藥理學。E-mail：chixiaohua93@126.com

遲小華，女，副主任藥師，研究方向：臨床藥理學。E-mail：yangsongru312@163.com