自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平變化

芮志蓮

自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平變化

芮志蓮

目的探討自身免疫性肝炎（AIH）患者外周血CD8+T細(xì)胞程序性死亡因子（PD-1）表達(dá)水平的變化。方法隨機(jī)選取我院收治的AIH患者25例和健康志愿者25例，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1分子和PD-1分子受體（PD-L1）表達(dá)水平。結(jié)果與健康人比，AIH血CD8+T細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)陽(yáng)性百分比分別為（2.6±0.1）%和（2.1±0.8）%，明顯高于健康人【（0.5±0.2）%和（0.4±0.1）%，P＜0.01）；10例男性AIH患者血CD8+T細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)陽(yáng)性百分比分別為（1.4±0.5）%和（2.3±0.6）%，顯著低于15例女性患者【（3.8±0.8）%和（2.5±0.5）%），P＜0.05）；經(jīng)皮質(zhì)激素治療4 w，25例AIH患者獲得病情緩解。AIH患者在緩解期PD-1/PD-L1表達(dá)水平分別為（3.3±0.2）%和（2.8±0.3）%。結(jié)論AHI患者外周血CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平升高，與疾病活動(dòng)可能存在密切的關(guān)系。

自身免疫性肝炎；CD8+T細(xì)胞；程序性死亡因子-1；程序性死亡因子受體-1

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種復(fù)雜的免疫損傷性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)理至今尚不明確。有學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病與遺傳易感和病毒感染等多方面因素有關(guān)[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，人體存在一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化和活化抑制傳導(dǎo)信號(hào)的共刺激分子，即程序性死亡因子（programmed death-l，PD-1）[4]。由于PD-1可以通過(guò)與其配體（programmed death ligand 1，PD-L1）的互相作用，使得效應(yīng)性或記憶性T淋巴細(xì)胞功能和首次免疫應(yīng)答水平降低，起到抑制免疫反應(yīng)的作用[5]。病毒性疾病的進(jìn)展過(guò)程與PD-1信號(hào)通路密切相關(guān)。PD-1還與糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的進(jìn)展有關(guān)[6，7]。本研究檢測(cè)了AIH患者血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)水平，以探討PD-1在AIH發(fā)病過(guò)程中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2013年1月～2015年12月我院收治的AIH患者25例，男10例，女15例；平均年齡為42.2±1.7歲。根據(jù)2010年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)（AASLD）更新的有關(guān)AIH治療指南以及2008年國(guó)際自身免疫性肝炎小組（IAIHG）提出的AIH簡(jiǎn)化診斷積分系統(tǒng)進(jìn)行臨床診斷。其中8例患者經(jīng)服用潑尼松龍后癥狀有所緩解，其余17例患者由于病情發(fā)展至晚期，故未行相應(yīng)免疫抑制劑治療。排除遺傳代謝性、藥物性和酒精性肝病以及肝炎病毒感染患者。另選健康人25例，男10例，女15例；平均年齡為28.8±6.7歲。

1.2 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)水平檢測(cè)抽取空腹外周靜脈血3 ml，經(jīng)肝素抗凝。另取3支試管，取全血100 μl，分別加入小鼠抗人CD3-FITC、抗CD8-APC和抗PD-1-PE單克隆抗體（美國(guó)BD公司）10 μl，于4℃避光環(huán)境下孵育30 min，加入10倍稀釋后的紅細(xì)胞裂解液2 ml，室溫避光靜置15 min。待紅細(xì)胞完全溶血后，加入緩沖液，重復(fù)洗滌3次。另取2%多聚甲醛300 μl重懸細(xì)胞，立刻上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，應(yīng)用BD Cell Quest軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群外周血CD8+T細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)水平比較與健康人比，AIH患者血CD8+T細(xì)胞PD-1和PD-L1分子陽(yáng)性百分比均顯著升高（P＜0.01，表1）。

表1 兩組人群外周血CD8+T細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)水平（%，±s）比較

表1 兩組人群外周血CD8+T細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)水平（%，±s）比較

與健康人比，①P＜0.01

例數(shù)PD-1+/CD8+PD-L1+/CD8+AIH252.6±0.1①2.1±0.8①健康人250.5±0.20.4.±0.1

2.2 不同性別AIH患者血CD8+T細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)水平比較10例男性AIH患者血CD8+T細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)陽(yáng)性百分比分別為（1.4±0.5）%和（2.3±0.6）%，顯著低于15例女性患者【（3.8±0.8）%和（2.5±0.5）%），P＜0.05）。

2.3 不同疾病分期AIH患者血CD8+T細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)水平比較給予所有患者強(qiáng)的松0.8～1.0 mg·kg-1·d-1治療，4周后逐漸減量。所有患者經(jīng)治療后谷丙轉(zhuǎn)氨酶降低，球蛋白及膽紅素水平下降，達(dá)到緩解。AIH患者在緩解期PD-1/PD-L1表達(dá)水平分別為（3.3±0.2）%和（2.8±0.3）%。

3 討論

PD-1是最近新發(fā)現(xiàn)的CD28家族中的一種抑制傳導(dǎo)信號(hào)的共刺激分子，它不僅具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化的功能，可以活化T淋巴細(xì)胞[8，9]。盡管PD-1共刺激分子與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4在氨基酸分子結(jié)構(gòu)上面具有23%的同源性，但在表達(dá)方面PD-1卻與其很不一致，在活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞和髓系細(xì)胞上PD-1具有更多的表達(dá)[10]，提示在免疫調(diào)節(jié)方面PD-1比CTLA-4作用范圍更廣。由于PD-1可以與其配體PD-L1互相作用，通過(guò)細(xì)胞胞漿尾部免疫受體，使得效應(yīng)性或記憶性T淋巴細(xì)胞功能和首次免疫應(yīng)答水平降低，從而起到負(fù)性調(diào)控抑制免疫反應(yīng)的作用[11,12]。有大量的實(shí)驗(yàn)觀察證明PD-1不僅對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌、增殖方面起到抑制作用，而且對(duì)T細(xì)胞的免疫殺傷能力等方面也存在一定程度的抑制，故通過(guò)阻斷上述免疫抑制通路便可以在一定程度上恢復(fù)T細(xì)胞的功能[13，14]。病毒特異性CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平在HIV、慢性HBV、HCV感染患者中明顯升高，故HIV、慢性HBV、HCV感染患者由于免疫功能受到抑制，導(dǎo)致患者處于長(zhǎng)期慢感染狀態(tài)[15]。在機(jī)體免疫應(yīng)答的初始和效應(yīng)階段，PD-1/PD-L1通路起到抑制作用而達(dá)到避免機(jī)體因免疫過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[16]。

本研究從性別和疾病分期的角度出發(fā)，通過(guò)對(duì)AIH患者血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，從而探討PD-1在AIH發(fā)病過(guò)程中的作用和意義。研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照人群相比，AIH患者血CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平明顯升高，且兩組間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示可能是AIH患者自身免疫反應(yīng)的代償作用使得PD-l表達(dá)水平升高，但機(jī)體的代償作用并不能控制病情的進(jìn)一步發(fā)展，病情并無(wú)好轉(zhuǎn)。除此之外，AIH患者發(fā)病期PD-1表達(dá)水平略低于緩解期，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑治療的功效可能是由于PD-1通路的表達(dá)水平增加。在自身免疫性疾病方面，PD-1/PD-L1通路可以起到一定的預(yù)防作用，上級(jí)刺激信號(hào)的持續(xù)時(shí)長(zhǎng)以及信號(hào)強(qiáng)弱等與其通路活化后的表達(dá)水平密切相關(guān)。在性別方面，不同性別的AIH患者和健康對(duì)照人群血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)水平有所差異，PD-1通路活化后的表達(dá)水平在女性群體中表達(dá)較男性群體高，但兩組人群差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于女性人群較易出現(xiàn)自身免疫肝炎的原因則需進(jìn)一步研究。

綜上所述，自身免疫性肝炎的發(fā)病可能與PD-1表達(dá)水平密切相關(guān)。對(duì)AIH患者體內(nèi)PD-1通路表達(dá)增強(qiáng)的研究有重要的臨床意義，通過(guò)檢測(cè)AIH患者外周血PD-1的表達(dá)程度，可以作為一種參考指標(biāo)診斷患者體內(nèi)存在一定程度的免疫功能紊亂。本研究未對(duì)PD-1在B淋巴細(xì)胞以及其它細(xì)胞亞群的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，其對(duì)免疫功能的影響也需要進(jìn)一步研究。

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（收稿：2016-09-26）

（本文編輯：陳宗炳）

Programmed cell death-1 and programmed cell death-1 receptor on peripheral blood CD8+T lymphocytes in patients with autoimmunehepatitis

Rui Zhilian.Clinical Laboratory，People’s Hospital，Liyang 213300，Jiangsu Province，China

Autoimmune hepatitis；CD8+T lymphocytes；Programmed cell death-1；Programmed cell death-1 ligand

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.03.025

213300江蘇省溧陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

芮志蓮，女，49歲，大學(xué)本科，副主任技師。E-mail：ruizhilian3480@126.com