土壤病毒生態(tài)學(xué)研究方法

韓麗麗, 于丹婷,2, 賀紀(jì)正,*

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100085 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

土壤病毒生態(tài)學(xué)研究方法

韓麗麗1, 于丹婷1,2, 賀紀(jì)正1,*

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100085 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

病毒是地球上最豐富的生物實(shí)體,每克土壤中可包含數(shù)以億計(jì)的病毒,它不僅影響土壤中其它微生物的群落組成、土壤元素的生物地球化學(xué)循環(huán),還會(huì)影響土壤微生物的物種進(jìn)化,甚至影響植物、動(dòng)物和人體健康。目前人們對(duì)土壤中病毒的種類及豐度、分布特征以及功能引起的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)還知之甚少。在概述病毒生態(tài)學(xué)研究方法的基礎(chǔ)上,對(duì)土壤病毒的提取、純化、定量及分子生態(tài)學(xué)方法等基本流程進(jìn)行了比較分析,以期建立一套快速簡(jiǎn)便、高效穩(wěn)定的適用于土壤病毒研究的方法,并用于研究土壤病毒的多樣性及分布特征,探討病毒在環(huán)境中的生存和傳播機(jī)制,為土壤病毒的防控及開發(fā)利用提供支撐。

土壤病毒；病毒生態(tài)學(xué)；宏病毒組學(xué)；分子生物學(xué)方法

病毒是地球上最豐富的生物實(shí)體,對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的生物地球化學(xué)循環(huán)、微生物群落組成以及土壤基因資源的多樣性發(fā)揮著重要作用。首先,病毒能夠侵染細(xì)菌、真菌、藍(lán)細(xì)菌等微生物,影響它們的生理代謝及死亡率,從而影響生態(tài)系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性；其次,由于病毒侵染導(dǎo)致的細(xì)胞裂解釋放的有機(jī)物影響環(huán)境中其它生物的養(yǎng)分利用,從而影響環(huán)境中元素的生物地球化學(xué)循環(huán)；第三,噬菌體引起宿主細(xì)胞裂解并釋放出DNA,釋放到環(huán)境中的DNA被其它微生物通過(guò)轉(zhuǎn)錄方式吸收、整合,引起微生物的遺傳變異,推動(dòng)微生物種群的進(jìn)化。同時(shí),土壤的高度異質(zhì)性及其多樣的生物環(huán)境為病毒提供了豐富而多樣的寄生環(huán)境,更利于病毒長(zhǎng)期生存和繁殖。

盡管病毒在土壤環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用,但由于其個(gè)體微小、基因組含量低、缺乏通用基因、進(jìn)化速度快生命周期短等特點(diǎn),使得土壤病毒生態(tài)學(xué)的研究進(jìn)展緩慢。病毒生態(tài)學(xué)研究方法經(jīng)歷了表型分析、單基因分析、基因組分析及宏基因組分析等幾個(gè)重要階段。如20世紀(jì)90年代,科學(xué)家們利用顯微技術(shù)對(duì)病毒和細(xì)菌豐度的地域差異進(jìn)行過(guò)大量研究,發(fā)現(xiàn)在撒哈拉及納米布沙漠這類極端環(huán)境中均存在著非常獨(dú)特的噬菌體類群[1-2]。隨著技術(shù)的發(fā)展,更多的研究結(jié)合了表型和分子生物學(xué)方法,如將透射電子顯微鏡(TEM：Transmission Electron Microscope)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE：Pulse Field Gel Electrophoresis)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD：Random Amplified Polymorphic DNA analysis)方法相結(jié)合。這類方法可有效地用于研究單個(gè)分離的噬菌體,也可對(duì)噬菌體的群體組成進(jìn)行研究。這類基于基因組水平的研究方法還可用于評(píng)價(jià)不同噬菌體在環(huán)境中的分布,如研究發(fā)現(xiàn)某些海洋噬菌體基因組只在特定的地點(diǎn)出現(xiàn),而其它一些噬菌體分布卻很廣[3]。有研究利用RAPD技術(shù)研究還發(fā)現(xiàn)弧菌噬菌體的豐度和地理分布沒(méi)有直接關(guān)系,而是受生境類型所驅(qū)動(dòng),如與海水、沉積物以及無(wú)脊椎動(dòng)物等生境相關(guān)[4]。

測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和日益廣泛的應(yīng)用,突破了探尋環(huán)境微生物黑箱的瓶頸。關(guān)于病毒基因組的測(cè)序始于1977年,第1株被測(cè)序的病毒是侵染大腸桿菌的ΦΧ174。 2002年,Brcitbart等[5]首次通過(guò)鳥槍測(cè)序法研究海洋病毒的宏基因組。2005年,Edwards等[6]提出了病毒宏基因組的概念。Hurwitz等[7]采用比較基因組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析方法分析了海洋病毒群落的生態(tài)驅(qū)動(dòng)模型。Bolduc等[8]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析方法揭示了黃石酸性熱泉中病毒的群體組成及相互關(guān)系。截止至2015年10月NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄了4885株病毒的全基因組序列。

圖1 土壤病毒生態(tài)學(xué)研究方法流程Fig.1 Research method process of soil viral ecology

與海水及熱泉樣品相比,土壤樣品具有異質(zhì)性高、成份復(fù)雜等特點(diǎn),從土壤中分離提取高純病毒面臨更多的困難,本文在對(duì)病毒生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展綜述的基礎(chǔ)上[9],進(jìn)一步對(duì)病毒生態(tài)學(xué)研究方法作一簡(jiǎn)要概述。在對(duì)海洋及其它環(huán)境病毒的提取、純化、定量及分子生態(tài)學(xué)方法進(jìn)行比較優(yōu)化的基礎(chǔ)上,重點(diǎn)建立一套快速簡(jiǎn)便、高效穩(wěn)定的適用于土壤病毒生態(tài)學(xué)研究的方法(圖1),主要包括病毒樣品的富集、定量、核酸提取、指紋圖譜分析及宏基因組測(cè)序等幾個(gè)部分。

1 土壤中病毒的提取及富集

1.1 土壤病毒的提取

病毒對(duì)土壤的吸附與病毒種類、土壤pH值、溫度、含水量、土壤結(jié)構(gòu)等環(huán)境因子密切相關(guān)。土壤病毒學(xué)研究的第一步是選擇合適、高效的提取方法高效地提取出吸附于土壤顆粒表面的病毒粒子。最常用的土壤病毒浸提液有4種[10],包括10%的牛肉膏、250 mmol/L甘氨酸溶液、10 mmol/L焦磷酸鈉和1%的檸檬酸鉀溶液。比較幾種浸提液對(duì)土壤病毒的提取效果,發(fā)現(xiàn)250 mmol/L甘氨酸溶液[11]和7%的牛肉膏提取液[12]最適用于提取污泥中的多種噬菌體,但是浸提出的病毒溶液難以過(guò)濾及進(jìn)行后續(xù)處理,浸提的病毒溶液粘稠,無(wú)法制片染色,也不可用熒光顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)；1%的檸檬酸鉀溶液提取農(nóng)田土壤病毒效率最高,并且可通過(guò)熒光顯微鏡直接計(jì)數(shù)；10 mmol/L焦磷酸鈉浸提效率略次于檸檬酸鉀浸提液,缺點(diǎn)是浸提液使用熒光顯微鏡觀察時(shí)易形成團(tuán)塊,無(wú)法計(jì)數(shù)。綜上,對(duì)于土壤病毒浸提液以250 mmol/L甘氨酸和1%的檸檬酸鉀溶液最為適用,具體選擇還要依據(jù)待提取病毒類型、土壤的理化性質(zhì)而定。

1.2 土壤病毒溶液的分離、純化及濃縮

1.2.1 切向流過(guò)濾法

切向流過(guò)濾(TFF：Tangential-flow filtration)是指液體流動(dòng)方向與過(guò)濾方向垂直的過(guò)濾形式,這種方法與常規(guī)過(guò)濾相比,具有液體流動(dòng)在過(guò)濾介質(zhì)表面產(chǎn)生剪切力,減小濾餅層顆粒物的堆積,不易堵塞,可保證穩(wěn)定的過(guò)濾速度等優(yōu)點(diǎn)。TFF主要用于從大量環(huán)境樣品中分離、濃縮病毒顆粒,設(shè)備及流程見(jiàn)圖2。TFF系統(tǒng)使用中空纖維膜濾柱,本文以孔徑0.2 μm的微濾柱和孔徑為100 kDa的超濾柱為例(圖2),介紹TFF系統(tǒng)過(guò)濾的原理及流程。孔徑0.2 μm的微濾柱主要用于過(guò)濾去除直徑大于0.2 μm的細(xì)菌及原生生物等,而直徑小于0.2 μm的病毒則能通過(guò)濾柱濾出(圖2),通過(guò)收集過(guò)濾液即可得到較純的病毒溶液。但此時(shí)的病毒溶液濃度很低,無(wú)法用于下一步研究,因此需要再通過(guò)100 kDa的超濾柱濃縮。更換濾柱后,直徑大于100 kDa的病毒被濾柱攔截,返回到回流端,而水溶液則能通過(guò)濾柱濾出(圖2),通過(guò)不斷回流過(guò)濾,減小病毒溶液體積,直至殘余液體體積小于100 mL。

圖2 TFF過(guò)濾系統(tǒng)及流程[13]Fig.2 TFF filtration system and procedure[13]

1.2.2 聚乙二醇沉淀法

聚乙二醇沉淀法(PEG：Polyethylene glycol)主要是利用PEG破壞病毒外殼蛋白質(zhì)分子表面的水化層而使病毒發(fā)生沉淀的方法,常用于病毒的提純濃縮,它可將TFF濃縮的病毒溶液(50—100 mL)中的病毒沉淀。首先向濃縮的病毒溶液中加入終濃度為0.5 mol/L的NaCl溶液,再加入等量的10% PEG6 000,4℃過(guò)夜放置后,8000 r/min 離心30 min,即可獲得病毒沉淀,再用緩沖液將病毒溶解成1—2 mL,用于下一步病毒的CsCl密度梯度離心或DNA的提取。

1.2.3 CsCl密度梯度離心法

由于環(huán)境中病毒的大小、質(zhì)量不一,密度也不一樣,密度梯度離心法既可用于病毒的濃縮,也可用于病毒顆粒的分離純化。每種病毒的大小不變,對(duì)應(yīng)不同介質(zhì)的密度層,Thurber等[13]在2009年的綜述文獻(xiàn)中作了較全面的歸納。該方法主要適用于純病毒的分離,缺點(diǎn)是儀器設(shè)備價(jià)格昂貴,一般實(shí)驗(yàn)室難以配備。

2 定量技術(shù)

2.1 熒光顯微計(jì)數(shù)

病毒定量目前最常用的方法就是熒光顯微(EFM：Epifluorescence microscope)計(jì)數(shù)法,該方法利用真空抽濾法將稀釋的病毒溶液中的病毒顆粒加載在濾膜上,通過(guò)高效的熒光染料染色后,將熒光信號(hào)分子和病毒DNA雙鏈結(jié)合,在熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)出熒光的病毒DNA,利用目鏡網(wǎng)格尺計(jì)數(shù)后推算出每克土壤樣品中病毒顆粒的數(shù)量。常用的熒光標(biāo)記物有Yo-Pro- 1、SYBR Green I和SYBR Gold等嵌入性染料[14],該方法與透射電鏡相比,價(jià)格較低、操作簡(jiǎn)便且重復(fù)性強(qiáng),適用于土壤樣品中未知病毒顆粒的定量研究。利用EFM直接計(jì)數(shù)有一點(diǎn)值得注意的是,由于可能對(duì)一些非病毒粒子染色,會(huì)高估病毒的豐度[15]。另外,與海水病毒樣品相比,土壤中有較高含量的腐殖酸,易導(dǎo)致較高的熒光背景干擾,這也是目前土壤病毒EFM計(jì)數(shù)方法無(wú)法避免的缺陷。

2.2 透射電鏡分類計(jì)數(shù)

在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展以前,透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)是作為病毒生態(tài)學(xué)研究的最主要手段,它不僅可應(yīng)用于病毒定量,還可對(duì)病毒進(jìn)行分類。具體方法：取50 g土壤樣品經(jīng)浸提、過(guò)濾純化后,取1 mL的純化提取物加入9 mL的滅菌去離子水,在Formvar-coated 650銅絲網(wǎng)網(wǎng)格上旋轉(zhuǎn),夾起銅網(wǎng)用濾紙吸取邊上多余液體,立刻將銅網(wǎng)倒扣在1% 醋酸雙氧鈾負(fù)染液滴上,靜置1—2 min,再夾起銅網(wǎng)吸去多余染液,自然晾干。在透射電鏡下先放大4000倍觀察全貌,再逐步放大到40000—85000倍觀察病毒形態(tài),對(duì)病毒進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。這種方法直接準(zhǔn)確,在熒光顯微鏡下不能觀察到的病毒可以通過(guò)透射電鏡觀察到,且結(jié)果精確度高,但是操作復(fù)雜,對(duì)儀器要求較高。

2.3 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)

流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer, FCM)是以激光為光源、檢測(cè)生物學(xué)顆粒的儀器。流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞、分子、生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)快速檢測(cè)的新型分析和分選技術(shù)。將待測(cè)細(xì)胞或微粒進(jìn)行熒光染色后制成懸液標(biāo)本,在一定氣體壓力下將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室,用不含細(xì)胞或微粒的緩沖液(鞘液)在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測(cè)細(xì)胞或微粒流呈一定角度,使鞘液包繞這細(xì)胞或微粒高速流動(dòng),形成一個(gè)圓形的流速(鞘流),待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包裹下單行排列,一次通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)區(qū)域。這種方法測(cè)定靈敏度高,對(duì)病毒濃度較高的樣品測(cè)試結(jié)果目前是最準(zhǔn)確的,但無(wú)法測(cè)試濃度較低的病毒樣品[16]。同熒光顯微計(jì)數(shù)方法一樣,流式細(xì)胞儀也只能檢測(cè)被熒光標(biāo)記的雙鏈DNA病毒,對(duì)單鏈DNA病毒和RNA病毒仍無(wú)法檢測(cè)。

2.4 病毒計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)

病毒計(jì)數(shù)儀是為了檢測(cè)病毒粒子而重新組裝的利用特殊液體控制、雙重染色標(biāo)記的流式細(xì)胞分析儀。對(duì)病毒的定量可以在5 min內(nèi)完成,且可以轉(zhuǎn)變成全自動(dòng)分析平臺(tái)。主要原理是通過(guò)聯(lián)合染色系統(tǒng),利用熒光染料對(duì)病毒基因組和包膜蛋白染色,通過(guò)流動(dòng)室時(shí)被激光激發(fā)后,標(biāo)記的蛋白和核酸分別產(chǎn)生黃色和紅色的熒光信號(hào)同時(shí)通過(guò)不同熒光通道被捕捉,只有同時(shí)產(chǎn)生這2種信號(hào)才計(jì)算為一個(gè)完整的病毒顆粒。這種方法相對(duì)于噬斑滴度計(jì)數(shù)法、熒光顯微計(jì)數(shù)法等具有分析速度快、成本低、樣品制備簡(jiǎn)單、靈敏度高等特點(diǎn),缺點(diǎn)在于儀器成本高、檢測(cè)的病毒種類有限,只能檢測(cè)人體及動(dòng)物體內(nèi)的20多種病毒,檢測(cè)結(jié)果不能代表環(huán)境中所有的病毒。

3 病毒核酸的提取及分子生態(tài)學(xué)方法

3.1 核酸提取

對(duì)富集的病毒濃縮液通過(guò)EFM或TEM方法檢測(cè)病毒純度,看是否有其他微生物細(xì)胞污染,對(duì)純化后的病毒提取核酸。裂解病毒前,使用DNase I降解土壤溶液中游離的DNA,并使用16S rRNA引物PCR檢測(cè)無(wú)細(xì)菌DNA污染后,進(jìn)行病毒核酸的提取。病毒核酸提取過(guò)程中最重要的是每一步操作都要做到不受病毒及其他微生物的污染。病毒核酸提取有多種試劑盒,如Mobio公司的PowerViralTMEnvironmental RNA/DNA Isolation Kit Sample、Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit、QIAampViral RNA Mini Kit等,或者使用甲酰胺或CTAB結(jié)合酚仿抽提法[13,17]大量提取,不同類型土壤適用的方法也不一樣,提取效率也不盡相同。提取的DNA如果濃度較低可通過(guò)Phi29DNA聚合酶擴(kuò)增,RNA樣品則需通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 目的基因多樣性

病毒生態(tài)學(xué)研究之所以遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于細(xì)菌和真核生物,最重要的原因之一就是病毒之間缺乏通用的標(biāo)記基因,但對(duì)于特定種類的病毒,科學(xué)家們還是發(fā)現(xiàn)了它們之間存在一些相對(duì)保守的標(biāo)記基因[18],并通過(guò)這些標(biāo)記基因序列研究特定病毒群體的多樣性。常用的標(biāo)記基因有編碼外殼蛋白基因,殼組裝蛋白基因,尾鞘蛋白基因,輔助代謝基因以及幾種聚合酶基因等。目前研究較多的是T4型噬菌體中編碼主要?dú)んw蛋白的g23基因。2005 年Filée 等[19]比較了16 株T4 型噬菌體單以g23 基因與以基因組中23 個(gè)基因組合繪制的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)這2種方法構(gòu)建的結(jié)果非常相似,證明g23 基因可以作為T4 型噬菌體類群劃分的分子基礎(chǔ),可以較好地表征復(fù)雜環(huán)境中T4 型噬菌體基因多樣性。g20基因編碼噬藻體殼組裝蛋白,也已被廣泛用于Myoviridae家族病毒多樣性的研究,研究覆蓋了稻田土壤,稻田水體,海洋及其它多種淡水環(huán)境[20- 24]。針對(duì)不同環(huán)境的g20基因多樣性研究也發(fā)現(xiàn),不同環(huán)境都有其獨(dú)特的類群,說(shuō)明g20基因的分布與其存在的環(huán)境有一定的關(guān)系[25]。藍(lán)藻噬菌體中的光合作用相關(guān)基因psbA和psbD也被廣泛應(yīng)用于藍(lán)藻噬菌體多樣性的研究[26- 28],psbA基因的系統(tǒng)發(fā)育研究表明它能分辨不同環(huán)境不同宿主菌,但卻和地理位置沒(méi)有相關(guān)性[29]。其它標(biāo)記基因如主要的殼粒蛋白基因mcp[30- 33]以及磷酸鹽饑餓狀態(tài)相關(guān)的phoH基因[34-35]在海洋噬菌體的研究中也有應(yīng)用,它們?cè)谑删w家族中的分布并沒(méi)有嚴(yán)格的限制。在噬菌體的核質(zhì)中也有一些和DNA合成相關(guān)的基因被作為標(biāo)記基因,如Podoviridae家族中T7型噬菌體中的DNA聚合酶基因polA[36-37],Myoviridae家族中的T4型噬菌體的DNA聚合酶基因g43[38],Family B家族中核質(zhì)大DNA(NCLDVs)中的DNA聚合酶基因polB[38-39],以及一些RNA病毒中的RNA聚合酶基因[40- 52]。

3.3 指紋圖譜技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,更多的病毒學(xué)研究引入了指紋圖譜技術(shù),如脈沖場(chǎng)凝膠電泳、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA等,并將其與TEM方法相結(jié)合,可對(duì)噬菌體的群體組成進(jìn)行研究。這種基于基因組水平的研究方法不僅顯示病毒的多樣性,還可結(jié)合表型橫向比較不同噬菌體在環(huán)境中的分布,如利用TEM和PFGE 結(jié)合研究海洋中藍(lán)藻噬菌體的基因組,雖然發(fā)現(xiàn)大部分分離的藍(lán)藻噬菌體和長(zhǎng)尾噬菌體表型很相似,但它們的基因組大小則分布在45—125 kb之間[43]；利用TEM和RAPD方法研究海洋弧菌噬菌體的時(shí)空分布；利用RAPD技術(shù)研究還發(fā)現(xiàn)弧菌噬菌體的豐度和地理分布沒(méi)有直接關(guān)系,而是受生境類型所驅(qū)動(dòng)等。

3.4 宏病毒組測(cè)序

宏病毒組測(cè)序(Viromics)是利用宏基因組學(xué)研究環(huán)境中病毒多樣性的高通量測(cè)序方法。目前宏基因組測(cè)序采用的方法有傳統(tǒng)的Sanger/鳥槍法和二代測(cè)序技術(shù)。應(yīng)用最為廣泛的莫過(guò)于第二代測(cè)序的三大測(cè)試平臺(tái),即羅氏公司的454 GS FLX測(cè)序平臺(tái)、ABI公司的SOLiD測(cè)序平臺(tái)和Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)。測(cè)序的過(guò)程大致如下：提取的病毒DNA(或RNA反轉(zhuǎn)成cDNA),經(jīng)質(zhì)檢合格后,利用超聲將DNA打斷,片段化的DNA經(jīng)過(guò)膠回收后,在兩端加接頭,再通過(guò)不同的方式將每個(gè)片段結(jié)合到微珠或芯片上,形成幾百萬(wàn)個(gè)同時(shí)反應(yīng)的微型反應(yīng)池,每個(gè)微型反應(yīng)池中的DNA片段通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的多拷貝作為測(cè)序的模板[44]；隨后通過(guò)酶延伸或寡核苷酸連接反應(yīng)同時(shí)對(duì)這些模板進(jìn)行測(cè)序。

獲得海量的序列數(shù)據(jù)后,最困難的問(wèn)題在于數(shù)據(jù)分析處理。原始序列經(jīng)過(guò)質(zhì)檢和優(yōu)化后,獲得的Reads拼接組裝后,利用MetaGene進(jìn)行基因預(yù)測(cè)；在此基礎(chǔ)上,可以獲得序列組成、物種組成、功能組成和群落特征等重要的宏基因組信息；數(shù)據(jù)分析的下一個(gè)關(guān)鍵步驟是根據(jù)相似度或序列組成對(duì)序列進(jìn)行歸類,基于相似度的方法將序列與KEGG、COG、SEED和ACLAME等功能數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲得病毒基因的功能注釋結(jié)果及豐度信息。通過(guò)病毒分類或功能基因的豐度差異比較分析、顯著性差異特征分析,為后續(xù)研究提供方向。這種方法的局限性在于價(jià)格相對(duì)昂貴,較依賴現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù),而病毒的未知序列及開放閱讀框數(shù)據(jù)庫(kù)比例很高,大部分的參考序列不能被鑒定。

和傳統(tǒng)的病毒研究方法如電子顯微鏡技術(shù),基因指紋圖譜或靶基因測(cè)序等相比,宏病毒組是唯一一個(gè)能反映樣點(diǎn)病毒群體多樣性和功能的方法[45]。利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究環(huán)境中病毒群落的多樣性,避免了病毒中沒(méi)有通用的標(biāo)記基因的缺點(diǎn),可以用來(lái)作為系統(tǒng)發(fā)育的指標(biāo),評(píng)估環(huán)境中病毒的多樣性[46]。但環(huán)境病毒學(xué)的研究還處于起步階段,病毒宏基因組學(xué)研究目前面臨的最大問(wèn)題是序列注釋困難,大約只有10%的序列能從已知數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)上[47]。

本文對(duì)已發(fā)表的土壤病毒研究文獻(xiàn)進(jìn)行了歸納整理,表1列出了不同地區(qū)土壤中優(yōu)勢(shì)病毒的分布及使用的研究方法。對(duì)土壤病毒的研究還是以宏病毒組學(xué)方法為主,比較不同地區(qū)的病毒分布,發(fā)現(xiàn)方法對(duì)病毒分類的影響尤為重要,同一實(shí)驗(yàn)室研究不同土壤中的病毒分布得出的結(jié)果可能相似,而不同實(shí)驗(yàn)室研究同種類型的土壤病毒分布其結(jié)果差異則較大,這可能是由于地理分布的影響,也可能是方法的選擇及操作對(duì)提取的病毒存在偏好性。有研究指出Phi29DNA聚合酶對(duì)擴(kuò)增環(huán)狀DNA具有偏好性,可能導(dǎo)致具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的ssDNA被選擇性的放大,這也許是多數(shù)土壤中ssDNA病毒占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的一個(gè)重要原因[48]。另外,在已發(fā)表的土壤病毒宏基因組研究中,還未見(jiàn)有RNA病毒的相關(guān)報(bào)道,這可能是由于病毒的基因組核酸含量低,對(duì)病毒RNA的提取更為困難,導(dǎo)致RNA病毒的研究仍存在很多困難,問(wèn)題的解決還有待全基因組擴(kuò)增技術(shù)和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展。

表1 不同地區(qū)土壤中的優(yōu)勢(shì)病毒及研究方法

MDAH：DNA聚合酶加熱處理；MDAX：DNA聚合酶不加熱處理

4 研究展望

病毒組學(xué)方法無(wú)疑是病毒生態(tài)學(xué)研究中最全面、最直接、獲得數(shù)據(jù)量最多的方法。面對(duì)如此龐大的信息量,僅分析病毒基因組信息和病毒基因多樣性信息是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,在生物信息學(xué)水平上,人們還需要開發(fā)更多的分析軟件進(jìn)一步挖掘病毒群體的多樣性及其與環(huán)境因子之間的相互關(guān)系；在進(jìn)化水平上,病毒引起基因水平轉(zhuǎn)移及其它轉(zhuǎn)座子的作用機(jī)制還有待研究,微生物基因組和病毒基因組之間的相互作用關(guān)系仍存在多種可能性；從技術(shù)的發(fā)展水平上,生物信息學(xué)和多學(xué)科交叉技術(shù)的發(fā)展,有助于推動(dòng)病毒群體動(dòng)力學(xué)和宏病毒組數(shù)據(jù)數(shù)學(xué)模型的建立,這也將是未來(lái)病毒生態(tài)學(xué)研究的重要發(fā)展趨勢(shì)。另外,目前的研究主要集中在雙鏈DNA病毒,對(duì)于單鏈DNA病毒及RNA病毒的研究還需依賴方法的發(fā)展。最后,有針對(duì)性地開展土壤病毒群體的生態(tài)分析,建立相關(guān)技術(shù)體系及土壤病毒資源庫(kù),將有助于對(duì)有益病毒開發(fā)利用及對(duì)關(guān)鍵有害病毒進(jìn)行控制。

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Research methods for soil viral ecology

HAN Lili1, YU Danting1,2, HE Jizheng1,*

1StateKeyLaboratoryofUrbanandRegionalEcology,ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

Viruses are the most abundant biological entities on the planet, and can reach 1010viral particles per gram of soil. Viruses affect the composition of microbial communities, mediate soil biogeochemical cycles, regulate soil microbial evolution, and threaten the health of plants and animals, including humans. However, there is limited knowledge on the abundance and distribution patterns of viruses and the manner in which they affect ecological processes. This study focuses on the comparative approaches to study soil viruses, including their extraction, purification, quantification, and methods pertaining to molecular ecology. The development of reliable and highly efficient methods to evaluate soil viral particles is desirable, because it aids the study of soil virus diversity and distribution. Therefore, these methods will improve our understanding of viral propagation mechanisms in soils, and will provide information on how to control viruses to ensure adequate public health and safety.

soil virus; viral ecology; metaviromics; molecular biological methods

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41571248, 41301265, 41230857)

2015- 11- 12;

日期:2016- 08- 02

10.5846/stxb201511122292

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jzhe@rcees.ac.cn

韓麗麗, 于丹婷, 賀紀(jì)正.土壤病毒生態(tài)學(xué)研究方法.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(6):1749- 1756.

Han L L, Yu D T, He J Z.Research methods for soil viral ecology.Acta Ecologica Sinica,2017,37(6):1749- 1756.