基于化學成分含量變化的金銀花藥材保質期預測Δ

葛朝暉，張海娟（臨沂大學藥學院，山東臨沂 276000）

基于化學成分含量變化的金銀花藥材保質期預測Δ

葛朝暉＊，張海娟#（臨沂大學藥學院，山東臨沂 276000）

目的：建立測定金銀花藥材中綠原酸和木犀草苷含量的方法，以探討金銀花在常溫密封環境下的保質期。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（綠原酸）、Agilent Zorbax SB-Phenyl（木犀草苷），流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87，V/V，綠原酸）、乙腈-0.5%冰醋酸溶液（梯度洗脫，木犀草苷），流速為1.0 mL/min，檢測波長為327 nm（綠原酸）、350 nm（木犀草苷），柱溫為30，進樣量為10 μL。結果：綠原酸、木犀草苷檢測質量濃度線性范圍分別為10～100 μg/mL（r＝0.998 6）、5～ 50 μg/mL（r＝0.999 3）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜4.0%；加樣回收率分別為95.78%～99.70%（RSD＝1.46%，n＝6）、96.30%～104.31%（RSD＝2.93%，n＝6）。滾簡殺青、烤房烘干、自然晾曬的藥材樣品中綠原酸和木犀草苷的含量在貯藏12個月后普遍降低了30%～40%。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于金銀花藥材中綠原酸和木犀草苷含量的測定；金銀花在貯藏1年后有效成分的含量顯著下降，有必要建立金銀花保質期規范，以保證臨床用藥的有效性。

金銀花；綠原酸；木犀草苷；保質期

金銀花為忍冬科Caprifoliaceae植物忍冬Lonicera japonica Thunb的干燥花蕾或帶初開的花，其具有清熱解毒、疏散風熱之功效，可用于癰腫療瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等癥的治療[1]。近年來，由于其市場需求增大，質量難以保持穩定[2]。經化學和藥理研究證實，綠原酸和木犀草苷是主要活性成分，其含量高低是評價金銀花藥材質量優劣的重要標志[3-6]。2015年版《中國藥典》（一部）規定：金銀花含綠原酸不得少于1.5%，木犀草苷不得少于0.050%。目前，對金銀花藥理作用的研究比較廣泛和深入，但其穩定性的研究較少，在貯藏過程中多憑借經驗進行，沒有可靠的質控方法。

為考察金銀花的有效期，筆者通過留樣觀察，以綠原酸和木犀草苷為指標，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其含量，為評價金銀花藥材質量提供試驗依據。

1 材料

1.1 儀器

SURVEYOR型HPLC儀，包括DAD檢測器（美國Thermo Finnigan公司）；KQ2200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：35 kHz）；TG16-WS型高速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；FA2004N型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 試劑

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201314，純度：≥98%）；木犀草苷對照品（天津一方科技有限公司，批號：20121227，純度：≥98%）；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，乙酸、無水乙醇為優級純，水為重蒸水。

1.3 藥材

金銀花藥材源自全國不同省市，采用不同加工方式，由山東九間棚藥業有限公司提供，經山東醫學高等專科學校馮麗娟教授鑒定為真品。樣品收集之后研磨過4號篩，密封貯藏。取藥材樣品18份，每份約50 g，以密封袋封口室溫貯藏。分別于貯藏1個月（Y1）和12個月（Y2）時測定藥材樣品相關指標。

表1 金銀花藥材信息Tab 1 Information of L.japonicae

2 方法與結果

2.1 綠原酸的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm，柱溫：30 ，進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數以綠原酸峰計不少于1 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC Chromatograms

2.1.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇溶液制成質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇溶液50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.1.4 線性關系考察 分別精密量取“2.1.2”項下對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以綠原酸質量濃度（x，g/L）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得綠原酸回歸方程為y＝28 061x－46 304（r＝0.998 6）。結果表明，綠原酸檢測質量濃度線性范圍為10～100 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，綠原酸峰面積的RSD＝0.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸峰面積的RSD＝0.81%（n＝5），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（編號：S1）適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定并計算平均含量。結果，綠原酸平均含量為2.19%，RSD＝0.25%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（編號：S1）適量，共6份，分別加入一定質量的綠原酸對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.1.9 樣品中綠原酸含量測定 取18批藥材樣品各適量，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中綠原酸含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 3 Results of contents determination of samples （n＝3，%）

2.2 木犀草苷的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Agilent Zorbax SB-Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%→20%A；15～30 min，20%A；30～40 min，20%→30%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：350 nm；柱溫：30 ；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數以木犀草苷峰計不少于20 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇溶液制成質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加70%乙醇溶液50 mL，稱定質量，超聲處理60 min，放冷，再次稱定質量，加70%乙醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶液溶解，移至5 mL量瓶中，加70%乙醇溶液定容，搖勻，即得。

2.2.4 線性關系考察 分別精密量取“2.2.2”項下對照品溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%乙醇溶液定容，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以木犀草苷質量濃度（x，g/L）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得木犀草苷回歸方程為y＝29 771x－13 725（r＝0.999 3）。結果表明，木犀草苷檢測質量濃度線性范圍為5～50 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，木犀草苷峰面積的RSD＝3.36%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，木犀草苷峰面積的RSD＝1.37%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（編號：S1）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定并計算平均含量。結果，木犀草苷平均含量為0.05%，RSD＝2.36%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（編號：S1）適量，共6份，分別加入一定質量的木犀草苷對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.2.9 樣品中木犀草苷含量測定 取18批藥材樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中木犀草苷含量，結果見表3。

3 討論

筆者采用HPLC法測定金銀花不同炮制品中綠原酸和木犀草苷的含量，結果顯示其含量順序為滾筒殺青＞烤房烘干＞自然晾曬。這表明，金銀花采用烘干和曬干炮制方法的有效成分含量較低，采用滾筒殺青方法的有效成分含量最高。這可能是由于滾筒殺青能使金銀花瞬間高速受熱，多酚氧化酶迅速失活，再快速烘干，使水分迅速失散，避免了有效成分的損失[7-8]。在傳統的自然晾曬或烤房烘干的炮制方法中，需時較長且更易受外界環境影響，故有效成分含量顯著降低。

本試驗中，3種炮制方法的藥材樣品中綠原酸和木犀草苷的含量在貯藏12個月后普遍降低了30%～40%。藥材樣品粉粹后比表面積增大會使成分降解速率增加，因此藥材的貯藏期應該大于本試驗數據結果，但本試驗結果可作為參考[9]。

研究表明，金銀花藥材中有效成分的含量受物種、生態環境、栽培措施、物候期、采收、加工、貯藏時間及炮制方法等多種因素影響[8]，本試驗只對貯藏時間和炮制方法對藥材的影響進行了探討。為了確定中藥材的保質期，應該在綜合考慮影響中藥材的產地、采收加工、晾曬貯藏、炮制過程及包裝等前提下，通過試驗得到各種數據，經過統計分析，得到各種影響因素與中藥材質量變化的相關性，為中藥材保質期的確定提出科學依據；且因為中藥材的有效成分復雜，不能單一用某種成分來衡量其有效期，應尋找更全面適合中藥有效期的確定方法，結合藥效評價和臨床應用實際，制訂出科學合理的中藥材保質期。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：221.

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[3] 朱丹，李瓊，張春花，等.不同產地金銀花中綠原酸、木犀草苷和總黃酮含量的比較研究[J].廣西醫科大學學報，2016，33（1）：15-19.

[4] 牛曉雪，崔旭盛，蘇賀，等.高效液相色譜法同時測定忍冬中7種成分[J].色譜，2012，30（2）：211-214.

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[6] 彭素琴，劉郁林.不同品種金銀花不同花期綠原酸含量比較[J].安徽農業科學，2010，38（14）：7296-7298.

[7] 宋健，張會敏，石俊英.金銀花最佳產地加工方法：殺青烘干干燥法[J].中藥材，2008，31（4）：489-491.

[8] 胡璇，李衛東，李歐，等.滾筒殺青烘干加工方法對四倍體金銀花藥材質量的影響[J].中國中藥雜志，2012，37 （17）：2554-2557.

[9] 薛志平，王金梅，劉杰，等.初均速法預測金銀花的有效期[J].中國中藥雜志，2012，37（21）：3179-3181.

Forecast on Shelf Life of Lonicerae japonicae Based on Its Chemical Components Variation

GE Zhaohui，ZHANG Haijuan（School of Pharmacy，Linyi University，Shandong Linyi 276000，China）

OBJECTIVE:To establish a method for determining the contents of chlorogenic acid and luteoloside in Lonicerae japonicae，and to explore the shelf life of L.japonicae under ordinary temperature and sealed environment.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent Zorbax SB-C18（chlorogenic acid）column and Agilent Zorbax SB-Phenyl（galuteolin）with mobile phase consisted of acetonitrile-0.4%phosphoric acid（13∶87，V/V），acetonitrile-0.5%glacial acetic acid（gradient elution，galuteolin）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 327 nm（chlorogenic acid）and 350 nm（galuteolin）.The column temperature was 30 ，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear range of chlorogenic acid and galuteolin were 10-100 μg/mL（r＝0.998 6），5-50 μg/mL（r＝0.999 3），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 4.0%.Recoveries were 95.78%-99.70%（RSD＝1.46%，n＝6）、96.30%-104.31% （RSD＝2.93%，n＝6）.The contents of chlorogenic acid and galuteolin in roller method，baking method and natural drying method of processed L.japonicae were all decreased by 30%-40%after stored for 12 months.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and repeatable，and can be used for simultanoue determination of chlorogenic acid and luteoloside in L.japonicae. The contents of active components in L.japonicae decrease significantly after stored for 12 months.It is necessary to establish shelf life standard of L.japonicae，so as to guarantee the effectiveness of drug use in the clinic.

Lonicerae japonicae；Chlorogenic acid；Luteoloside；Shelf life

R917；R927.2

A

1001-0408（2017）12-1677-04

2016-05-09

2016-07-02）

（編輯：張 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.41201526）；山東省教育廳高校科研發展計劃項目（No.J12LM59）

＊博士研究生。研究方向：中藥質量控制。E-mail：gezhaohui@lyu.edu.cn

#通信作者：副教授。研究方向：天然活性物質。電話：0539-8766716。E-mail：hjzhang2004@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.26