柱后衍生陽離子交換色譜法同時測定新疆產貝母中17種氨基酸的含量Δ

艾則孜·莫合買提，沙麗娜，阿布力米提·伊力（.中國科學院新疆理化技術研究所，烏魯木齊 800；2.中國科學院研究生院，北京 0009；.新疆食品藥品檢驗所，烏魯木齊 80000）

柱后衍生陽離子交換色譜法同時測定新疆產貝母中17種氨基酸的含量Δ

艾則孜·莫合買提1，2，3＊，沙麗娜3，阿布力米提·伊力1（1.中國科學院新疆理化技術研究所，烏魯木齊 830011；2.中國科學院研究生院，北京 100039；3.新疆食品藥品檢驗所，烏魯木齊 830000）

目的：建立同時測定新疆產貝母中17種氨基酸含量的方法。方法：采用陽離子交換色譜柱分離17種氨基酸；采用柱后衍生陽離子交換色譜法測定藥材中17種氨基酸的含量：色譜柱為LCAK 06/Na柱，流動相A為檸檬酸三鈉11.9 g、檸檬酸6 g、苯酚1 g，加水溶解，再加65 mL甲醇和6 mL濃鹽酸，加水定容（調pH至3.4），流動相B為檸檬酸三鈉11.9 g、氫氧化鈉2.8 g、苯酚1 g、硼酸5.0 g，加水溶解并定容（調pH至10.8）（梯度洗脫），流速為0.45 mL/min（A泵）、0.25 mL/min（M泵），檢測波長為440 nm（脯氨酸）、570 nm（其余氨基酸），進樣量為50 μL。結果：天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸和脯氨酸檢測濃度線性范圍均為20～400 nmol/mL（除胱氨酸10～200 nmol/mL）（r均大于0.989 0）；精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的RSD＜2.0%；檢測限除胱氨酸外（0.08 nmol/mL）其余氨基酸均為0.16 nmol/mL；加樣回收率為98.5%～99.5%（RSD為0.06%～0.21%，n＝6）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于新疆產貝母中氨基酸含量的同時測定。

貝母；氨基酸；柱后衍生化；陽離子交換色譜法

貝母是一種常用的藥材，百合科Lilianceae貝母屬Fritillaria多年生草本植物，其鱗莖可供藥用，具有清熱化痰、潤肺止咳等功效，可用于肺熱咳嗽、胸悶痰黏等癥的治療。在新疆分布量比較豐富的有新疆貝母F. walujewii Rgl[1-2]、伊犁貝母F.kpallidiflora Schrenk[3-4]、輪葉貝母F.tortifolia、黃花貝母F.verticillata、大白花貝母F.verticillata var.albidoflora、裕民貝母F.yuminensis、灘貝母F.karelinii和小花貝母F.meleagroides等，以上統(tǒng)稱為新疆產貝母[1-4]。貝母主要成分為異甾生物堿、多糖和蛋白質等，其所含的氨基酸具有特殊的生物活性[5]。目前，對其生物堿成分報道較多，氨基酸的測定則較少見報道。為此，本試驗對新疆產貝母中氨基酸進行了研究。

目前，國內外氨基酸分析方法主要分為直接分析法和衍生化間接分析法等兩類。其中，衍生化方式又分為柱前、柱上和柱后衍生化等3種模式[6-9]。Sykam氨基酸分析儀廣泛用于檢測植物、動物中的氨基酸，主要采用柱后衍生模式，其基本原理與高效液相色譜法（HPLC）相似。同時，該方法對氨基酸分析進行了一系列細節(jié)的優(yōu)化，如氮氣保護、惰性管路、在線脫氣、洗脫梯度及柱溫梯度控制等。氨基酸分析儀使用時，通常利用Na+型或Li+型磺酸基強酸性陽離子交換樹脂。由于氨基酸為兩性電解質，在酸性條件下，能被樹脂表面的活性基團（－SO3－）吸附，通過不同pH系列的洗脫液使氨基酸逐步洗脫下來，以氨基酸與活性基團親和力最弱洗脫，即依次為酸性氨基酸、羥基氨基酸和中性氨基酸、芳香族氨基酸和堿性氨基酸等。Na+型樹脂一般用于蛋白質水解液中的氨基酸分析；Li+型樹脂一般用于生理體液中的氨基酸分析。本試驗采用陽離子交換色譜法分離17種氨基酸，并采用柱后衍生化色譜法測定貝母中氨基酸的含量。

1 材料

1.1 儀器

S433D/S433型氨基酸分析儀，包括S5200全自動進樣器、S4300氨基酸反應模塊、S2100梯度泵（德國Sykam公司）；Delta 320臺式酸度計、AG135型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；WG2003SBC型臺式電熱干燥箱（重慶四大實驗儀器有限公司）；232 HK型高速離心機（德國Hermle公司）。

1.2 試劑

天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）混合對照品（批號：07070114-6006001，各氨基酸純度均＞99.2%）、緩沖液A、緩沖液B、再生液、樣品稀釋液均購自德國Sykam公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

10批貝母藥材（見表1）經新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所蘇來曼·哈力克主任藥師鑒定為真品。采集時間為2014－2015年。

表1 貝母藥材來源Tab 1 Sources of Fritillariae Pallidiflorae Bulbus

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：LCAK 06/Na柱；流動相：流動相A（稱取檸檬酸三鈉11.9 g、檸檬酸6 g、苯酚1 g，置于1 L量瓶中，加適量水溶解，再加65 mL甲醇和6 mL濃鹽酸，加水定容，調pH至3.4）、流動相B（稱取檸檬酸三鈉11.9 g、氫氧化鈉2.8 g、苯酚1 g、硼酸5.0 g，置于1 L量瓶中，加水溶解并定容，調pH至10.8），梯度洗脫（0～8 min，100%A；8～15 min，100%→85%A；15～22 min，85%→80%A；22～27 min，80%→75%A；27～34 min，75%→0 A；34～51.1 min，0 A；51.1～51.2 min，0→100%A；51.2～65 min，100%A）；流速：0.45 mL/min（A泵）、0.25 mL/min （M泵）；檢測波長：440 nm（Pro）、570 nm（其余氨基酸）；進樣量：50 μL。

2.2 溶液的制備2.2.1 混合對照品溶液 精密量取混合氨基酸對照品適量，加樣品稀釋液制成Cys、其余16種氨基酸濃度分別為100、200 nmol/L的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取樣品粉末約1.0 g，置于水解管中，加6 mol/L鹽酸10 mL，通氮氣封口，置于110 烘箱內水解24 h，取出放冷至室溫，打開水解管，以半徑為12 cm、3 000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL，置于蒸發(fā)皿中，揮盡鹽酸，殘渣加少量樣品稀釋液多次溶解并定容至20 mL，經微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果表明，在440、570 nm波長處，混合對照品溶液和供試品溶液中的氨基酸得到了很好地分離。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，加樣品稀釋液制成濃度為20、40、80、120、200、400 nmol/mL（Cys濃度為10、20、40、60、100、200 nmol/mL）的系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測氨基酸濃度（x，nmol/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表2。

表2 回歸方程、線性范圍與檢測限Tab 2 Regression equations，linear range and limits of detection

2.5 檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，17個待測氨基酸峰面積的RSD為0.03%～0.53%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：F10）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，17個待測氨基酸峰面積的RSD為0.62%～1.22%（n＝7），表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（編號：F10）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，17個待測氨基酸峰面積的RSD為0.07%～1.74%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（編號：F10）適量，共6份，分別加入高、低濃度的待測氨基酸對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.10 樣品含量測定

取10批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表4。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results of recovery test（n＝6）

表4 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

3 討論

氨基酸分析在醫(yī)藥、食品和動植物代謝產品檢測等方面應用非常廣泛，國外早已開展了氨基酸HPLC檢測方法的研究，國內也進行了這方面的探索。本試驗采用柱后衍生陽離子交換色譜法測定氨基酸含量，定量結果比較可靠。

筆者對不同水解溫度和時間（110 水解24 h，110 水解12 h，105 水解24 h）進行考察，結果110水解24 h較完全，樣品水解時一定要水解充分，衍生時間足夠；并且溫度不可過低，否則將造成衍生不完全。

試驗中所用的貝母來自不同年份同一采收季節(jié)，筆者分別測定了17種氨基酸的含量，其中有3種必須氨基酸的平均含量均大于0.5%，即Arg、Glu和Asp，尤其以Arg含量最高，這也說明貝母具有較高的藥用價值。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于新疆產貝母中氨基酸含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of Contents of 17 Amino Acids in Fritillariae Pallidiflorae Bulbus Produced in Xinjiang by Post-column Derivatization Cation-exchange Chromatography

Aziz·MOHAMMAT1，2，3，SHA Lina3，Ablumiti·YILI1（1.Xinjiang Technical Institute of Physics&Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Urumqi 830011，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China；3.Xinjiang Institute for Food and Drug Control，Urumqi 830000，China）

OBJECTIVE：To establish a method of contents determination of 17 amino acids in Fritillariae Pallidiflorae Bulbus produced in Xinjiang.METHODS：Cation-exchange column was used to separate 17 kinds of amino acids；post-column derivatization liquid chromatography was used to determine the contents of amino acids：the column was strong sulfonic acid cation exchange resin LCAK06/Na with mobile phase A（weighing trisodium citrate 11.9 g，citric acid 6 g，phenol 1 g，dissolving by water，then adding 65 mL of methanol and 6 mL of concentrated hydrochloric acid，bringing the volume with tap water，adjusting pH to 3.4），mobile phase B（weighing trisodium citrate 11.9 g，NaOH 2.8 g，phenol 1 g，boric acid 5.0 g，adding water to dissolve，adjustingpH to 10.8），gradient elution，flow rate was 0.45 mL/min for A pump and 0.25 mL/min for M pump，the detection wavelength was 440 nm for proline and 570 nm for the remaining amino acids，the injection volume was 50 μL.RESULTS：The linear range were 20～400 nmol/mL of aspartic acid，threonine，serine，glutamic acid，glycine，alanine，valine，methionine，isoleucine，leucine，tyrosine，phenylalanine，histidine，lysine，arginine，proline，10-200 nmol/mL of cystine（r were higher than 0.989 0）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；limits of detection were 0.16 nmol/mL except for cystine（0.08 nmol/ mL）；recovery was 98.5%-99.5%（RSD was 0.06%-0.21%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of amino acids in Fritillariae Pallidiflorae Bulbus produced in Xinjiang.

Fritillariae Pallidiflorae Bulbus；Amino acids；Post-column derivatization；Cation exchange chromatography

R927

A

1001-0408（2017）12-1680-04

2016-07-18

2016-09-02）

（編輯：張 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.U1403201）

＊主任藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：Qabdas@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.27