當歸種子蛋白質提取方法及SDS-PAGE技術體系研究Δ

張延紅，高素芳，王 燕，李金田，杜 弢（甘肅中醫藥大學藥學院，蘭州 730000）

當歸種子蛋白質提取方法及SDS-PAGE技術體系研究Δ

張延紅＊，高素芳，王 燕，李金田，杜 弢#（甘肅中醫藥大學藥學院，蘭州 730000）

目的：建立適用于當歸種子蛋白質提取及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的技術體系，為當歸種子蛋白質研究和品種純度檢測提供技術支撐。方法：以蛋白質含量和電泳條帶數量等為指標，采用濃縮膠法、鹽溶蛋白法、電極緩沖液法、二巰基蘇糖醇（DTT）法、尿素法、巰基乙醇法、三羥甲基氨基甲烷（Tris）法、丙酮沉淀法等8種方法提取當歸種子蛋白質，篩選最優提取方法；再以最優提取方法為基礎，考察不同料液比、樣品稀釋倍數（上樣量）和分離膠濃度對當歸種子蛋白質提取及SDS-PAGE效果的影響。結果：8種提取方法中以巰基乙醇法提取蛋白質的含量較高（29.931mg/g），且電泳條帶數目多、泳道背景清晰；當以巰基乙醇法為最優提取方法時，料液比為1∶10、上樣量為5倍、分離膠濃度為15%條件下電泳效果最好，共得到18條條帶。結論：建立的蛋白質提取方法和SDS-PAGE技術體系適用于當歸種子純度的檢測。

當歸；種子；蛋白質提取；SDS-PAGE

蛋白質是基因表達的產物，能反映生物DNA組成上的差異，幾乎所有植物種子都具有特異性種子蛋白，其電泳譜帶具有高度的穩定性、專一性。蛋白質電泳技術就是根據種子蛋白的這些特點，利用電泳譜帶的多態性來鑒定品種的真實性和純度。此外，種子蛋白作為遺傳標記常被用于種屬間關系、品種鑒定及植物繁育系統的鑒別。種子檢驗是保證種子質量的重要措施，采用電泳分離的蛋白圖譜檢測農作物種子純度已有文獻報道[1-2]。利用種子蛋白質電泳圖譜鑒定種子純度具有不需將種子萌發、送檢樣品可及時進行分析、電泳后的染色步驟相對簡單等優點。此外，該技術還可用于測定蛋白質分子量和蛋白質濃度，是許多研究領域的重要分析技術。當歸為傘形科多年生草本植物當歸[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根[3-4]，是甘肅特色藥材之一。本試驗以當歸種子為研究材料，對其蛋白質的提取方法及電泳條件進行研究，旨在建立適宜于當歸種子蛋白質提取和電泳的技術體系，為當歸種子蛋白質研究和品種純度檢測提供技術支撐。

1 材料

1.1 儀器

DYY-10C型電泳儀、DYCZ-23A型垂直電泳槽（北京市六一儀器廠）；BX7200HP超聲波清洗器（上海新苗醫療器械制造有限公司）；TGL16M型高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）。

1.2 種子與試劑

當歸種子由甘肅省定西市農業科學研究院劉效瑞老師提供，經晉玲教授鑒定為當歸種子；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、二巰基蘇糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、丙酮、甘油、考馬斯亮藍、十二烷基硫酸鈉（SDS）、冰醋酸、甲醇、甘氨酸等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 蛋白質提取

經查閱文獻[5-13]及預試驗確定選用以下蛋白質提取方法進行篩選比較。

2.1.1 濃縮膠法 在文獻[5]方法上加以改進。稱取當歸種子0.2 g，加稀釋4倍的濃縮膠緩沖液（0.5mmol/L的Tris-HCl，pH 6.7）2m L冰浴研磨，超聲震蕩30m in，離心（3 500 r/m in，離心半徑5 cm，下同）30m in，取上清液，加入等體積40%的蔗糖溶液，4℃貯存備用。

2.1.2 鹽溶蛋白法 稱取當歸種子0.2 g，加入1.5mol/L的氯化鈉溶液2m L，在冰浴條件下研磨，離心20m in，取上清液，4℃貯存備用[5]。

2.1.3 電極緩沖液法 在文獻[6]方法上加以改進。稱取當歸種子0.2 g，加入樣品提取液[40%的蔗糖10m L，電極緩沖液（3.03 g Tris，14.4 g甘氨酸，1.0 g SDS，加雙蒸水溶解定容至1 000m L，pH 8.3）2m L，加水8m L混勻]2m L在冰浴條件下研磨，離心20m in，取上清液，4℃貯存備用。

2.1.4 DTT法 稱取當歸種子0.2 g，加入50 mmol/L Tris-HCl（含1.5%DTT和0.6mmol/L的EDTA緩沖液，pH 8.0）樣品提取液2m L（4℃預冷備用），室溫浸泡1 h，然后研磨至糊狀后4℃下離心（10 000 r/min）20min，離心2次[5]，上清液即為蛋白質提取液。

2.1.5 尿素法 取32.43 g尿素、120μL乙二醇溶于1 000 m L雙蒸水中得到提取液。稱取冷藏30m in后的當歸種子0.2 g，研磨后裝入離心管中，加入提取液（料液比為1∶10），室溫下提取1 h后渦旋混合約1min，再于4℃下離心（10 000 r/min）10min，取上清液備用[7]。

2.1.6 巰基乙醇法 在文獻[8]方法上加以改進。稱取當歸種子0.2 g，加入pH 8.0的50mmol/L Tris-HCl（含1%SDS、1%巰基乙醇、40%的蔗糖溶液）提取液2 m L，置沸水中加熱3min，立即置于冰上冷卻，取上清液備用。

2.1.7 Tris法 稱取樣品0.2 g，加入pH 8.0的0.15mol/L Tris-HCl提取液2m L，4℃浸泡6 h，離心（4 000 r/m in）15min，取上清液備用[8]。

2.1.8 丙酮沉淀法 稱取當歸種子0.2 g，加入樣品提取液（pH 8.0的62.5 mmol/L Tris-HCl、0.5%SDS、10%甘油、5%巰基乙醇）2m L，渦旋混合30 s，4℃放置1 h。樣品搖勻后，在4℃下離心（12 000 r/m in）20min，上清液轉移至3 m L離心管中，加入1 m L預冷丙酮，搖勻，－20℃放置1 h沉降蛋白質，4℃下離心（5 000 r/m in）10m in，棄上清液。沉淀在－20℃放置1 h，使丙酮充分揮發，沉淀備用[5]。

2.2 蛋白質含量測定與電泳

蛋白質含量和純度是評價提取方法的重要指標，蛋白純度不同，對電泳的影響也不同。較多的雜質將嚴重影響電泳結果。采用考馬斯亮藍法測定上述8種方法提取的蛋白質含量[14]；采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術[15]，比較各方法提取的蛋白質電泳的條帶數目和泳道干凈程度，篩選適宜的蛋白質提取方法。本試驗數據均采用Excel 2003作圖，SPSS 18.0軟件進行Duncan多重比較。

2.2.1 電泳技術操作步驟 （1）電泳槽的安裝：將2塊玻璃板垂直插入玻璃槽固定好，將溶化的1.5%瓊脂趁熱注入電泳槽平板玻璃底部，以防漏液。（2）聚合：取配制好的分離膠（濃度10%）混勻后小心注入電泳槽的玻璃板間，留出約3 cm左右的空間以灌注濃縮膠[濃度3%，配制方法：蒸餾水2.7m L、30%丙烯酰胺（29.2 g）/N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（0.8 g）0.67 m L、濃縮膠緩沖液0.5 m L、10%SDS 50μL、10%過硫酸銨50μL、四甲基乙二胺4μL；濃縮膠緩沖液是0.5 mmol/L Tris-HCl（pH＝6.7）。將上述試劑混勻后，倒入玻璃板間（分離膠上方），插入梳子，室溫靜置聚合2 h左右。（3）電泳：待濃縮膠完全聚合后，取出梳子，吸去多余的水，用微量注射槍向加樣孔內點樣，在電泳槽中加電極緩沖液（將3.03 g Tris、14.4 g甘氨酸、1.0 g SDS溶入900m L超純水中，然后定容至1 000m L即為電極緩沖液）適量，并在上樣緩沖液中加7～8滴溴酚藍指示劑。接上電泳儀，恒壓60 V，待藍色溴酚藍移至分離膠時，轉換電壓至120V；待藍色的溴酚藍移至下端1～1.5 cm時，停止電泳。（4）染色和脫色：取出膠板后放入考馬斯亮藍G-250染色液，染色1 h。然后再用蒸餾水沖洗2遍，倒入脫色液，期間多次更換至背景清晰為止，拍照。

2.2.2 分離膠配方 配方見表1。

表1 分離膠配方（m L）Tab 1 Solution formula of separating gel（m L）

2.2.3 蛋白質含量測定及電泳結果 當歸種子8種提取方法的蛋白質含量測定結果見表2，電泳圖見圖1。

表2 不同提取方法蛋白質含量比較Tab 2 Com parison of protein contentsby different extractionm ethods

圖1 不同提取方法蛋白質電泳圖Fig 1 Protein electrophoretogram by different extractionm ethods

由表2及圖1可知，丙酮沉淀法提取的蛋白質含量最高，與其余7種方法比較差異有統計學意義（P＜0.05），但圖譜顯示該法電泳條帶較模糊；巰基乙醇法與DTT法提取的蛋白質含量差異無統計學意義（P＞0.05）；鹽溶蛋白法提取出的蛋白質含量較低，其電泳圖譜條帶較寬、條帶顏色淺淡；Tris法提取出的蛋白質含量最低，圖譜也顯示其條帶較寬、顏色較淡。故當歸種子不同提取方法的蛋白質含量測定結果與蛋白質電泳圖譜二者有一定的對應關系。

總的來說，8種方法電泳條帶多分布于中下部，其中巰基乙醇法電泳效果最好，總條帶數10條，明帶8條、暗帶2條，泳道背景清晰。尿素法、DTT法、電極緩沖液法、鹽溶蛋白法、濃縮膠法電泳條帶的數目和亮度差異不大，均為4～5條，其中鹽溶蛋白法的條帶明顯變寬。丙酮法和Tris法電泳條帶較模糊，數目較少。因此，巰基乙醇法是當歸種子最適宜的蛋白質提取方法。

2.3 提取與電泳條件的優化

在采用巰基乙醇法提取蛋白質的基礎上對提取條件（料液比）及電泳條件（上樣量、分離膠濃度）進行進一步的優化試驗。

2.3.1 料液比 稱取當歸種子0.2 g，分別加入1、2、3、4、 5m L樣品提取液，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25。按“2.1.6”項下方法提取，將提取的蛋白質樣品用上樣緩沖液（濃縮膠緩沖液1 m L、10%SDS 1.6m L、50%甘油0.8 m L、巰基乙醇0.4m L、0.05%溴酚藍0.2 m L、雙蒸水4.0m L，混合均勻）按1∶4稀釋[9]，比較蛋白質含量、電泳條帶數目和泳道干凈程度，篩選適宜的料液比，結果見表3、圖2A。

表3 不同料液比條件下蛋白質含量比較Tab 3 Com parison of p rotein contents under differentmaterials-liquid ratios

圖2 不同條件下蛋白質的電泳圖譜比較Fig 2 Com parison of protein electrophoretogram under different conditions

由表3可知，當料液比為1∶10時，提取液中的蛋白含量最高，與其余料液比比較差異具有統計學意義（P＜0.05），提取效果最好。由圖2A可見，不同料液比對電泳效果的影響顯著。料液比為1∶5時泳道顏色濃重，背景不干凈，條帶不清晰、拖尾嚴重，提取液的泳道顏色最深，且條帶較寬。其原因是提取液體積太少，蛋白質提取不充分，雜質太多，此結果與蛋白質含量測定結果相一致。當料液比為1∶10和1∶15時，電泳效果較好，泳道干凈，條帶清晰、數目多，泳道上方有極細的暗帶分出。當料液比為1∶20和1∶25時，泳道下部條帶顏色變淡；且料液比為1∶25時，條帶變模糊，第4、5條明帶間已無暗帶。因此，料液比優選1∶10。

2.3.2 樣品稀釋倍數（上樣量） 在“2.3.1”項試驗的基礎上，采用巰基乙醇法提取蛋白質，以料液比為1∶10提取種子蛋白質。取提取后的蛋白質樣品30μL用上樣緩沖液分別稀釋3、4、5、6、7、8、9、10、11、12倍，比較電泳條帶數目和泳道干凈程度，篩選適宜的稀釋倍數，結果見圖2B。

由圖2B可知，稀釋3倍的蛋白質液拖尾較嚴重，可能因蛋白質濃度太高所致。稀釋4、5、6、7倍的條帶數最多，總數11條，亮帶8條、暗帶3條，從下向上第4、5帶間可清晰看到2條暗帶。稀釋8～12倍的條帶顏色變淡變細，且有些暗帶消失。因此，樣品稀釋倍數優選5倍。

2.3.3 分離膠濃度 在“2.3.2”項試驗的基礎上，采用巰基乙醇法提取蛋白質，按料液比為1∶10、樣品稀釋5倍上樣。配制3%的濃縮膠及10%、12%、15%的分離膠進行蛋白質電泳，比較電泳條帶數目和泳道干凈程度，篩選適宜的分離膠濃度，詳見圖2C。

由圖2C可知，15%分離膠與10%、12%分離膠電泳效果比較，前者條帶數目明顯更多，且主要是在下部分離出更多清晰的亮帶和暗帶，中上部的亮帶差異不大，但有新的暗帶出現。因此，15%的分離膠可使蛋白質分離更完全，電泳得到18條帶，其中11條亮帶、7條暗帶。計算其分子量[8]介于11.88～30.18KD之間。

篩選后的當歸種子提取方法為巰基乙醇法，料液比為1∶10，電泳上樣量為稀釋5倍，分離膠濃度為15%。

3 討論

通過本次試驗建立了適合當歸種子蛋白質電泳的技術體系。不同提取方法對蛋白質含量及電泳效果的影響很大，本試驗采用8種提取方法，其中巰基乙醇法蛋白質提取和電泳效果均最好。其原因可能是提取液中的SDS使蛋白質非共價鍵和二硫鍵斷裂，并中和蛋白質表面電荷；同時加入的巰基乙醇是一種強還原劑，其可使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質溶解并與SDS定量結合[16-17]。由于SDS和巰基乙醇的雙重作用，蛋白質完全變性和解聚，解離成亞基或單個肽鏈，因此，蛋白質溶解性增加、提取量增加、電泳效果好。而丙酮沉淀法的提取液中也含有SDS和巰基乙醇，也取得了較好的提取效果，但丙酮沉淀法耗時長、方法復雜。在本試驗中該法圖譜顯示電泳條帶較模糊，其原因是該法提取的蛋白質呈固體狀，故上樣時將蛋白質沉淀用上樣緩沖液稀釋了8倍，而其余方法樣品只稀釋了5倍，故丙酮沉淀法的稀釋倍數大于其他方法。

本課題組通過黨參、大黃、紅芪、苦豆子、甘草、黃芪、板藍根和柴胡9種藥材種子蛋白質提取及SDSPAGE研究發現（待發表），巰基乙醇法均有很好的提取和電泳效果，適用性很廣，而且用時短，方法簡單易行，可供其他植物種子借鑒使用。

當歸種子蛋白質分子量較小，采用15%的分離膠較12%、10%的分離膠蛋白質電泳圖譜分離出的條帶更多，分離效果更好。在對9種藥材的種子蛋白質電泳時發現，15%的分離膠可獲得更多的電泳條帶。另外，在研究過程中本課題組發現利用冷藏和冷凍兩種方式保存了1周的蛋白質提取液，在電泳時冷凍法保存的蛋白質提取液其電泳條帶分離得更清晰，且在冷凍保存1個月后仍能取得良好的電泳效果。其原因可能是溫度越低越有利于蛋白質的保存。因此，冷凍法能夠更長時間地保存蛋白質提取液，不會導致蛋白變性。

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Study on the Protein Extraction M ethod in Angelicae sinensis Seed and Its SDS-PAGE Technical System

ZHANG Yanhong，GAO Sufang，WANG Yan，LIJintian，DU Tao（School of Pharmacy，Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China）

OBJECTIVE：To establish the technical system that is suitable for protein extracting in Angelicae sinensis seed and sodium dodecyl sulfate-polyacrylam ide gel electrophoresis（SDS-PAGE），and provide technical support for detecting the protein quality and variety purity.METHODS：Using protein content and number of electrophoretic bands as indexes，8 methods，including voncentrated gel method，salt-soluble protein method，electrode buffer method，dimercaptosyl alcohol（DTT）method，urea method，mercaptoethanolmethod，trimethylolaminomethane（Tris）method，and acetone precipitation method，were conducted to extract the protein in A.sinensis seed and screen the optimal extraction method.Then based on optimal extraction method，effects of differentmaterials-lipid ratios，sample dilution times（sample volume）and separate gel concentration on SDS-PAGE were investigated.RESULTS：Mercaptoethanolmethod extracted the highest protein contents（29.931 mg/g），w ith many electrophoretic bands and clear background.When mercaptoethanolmethod was used as optimal extraction method，electrophoresis effects were the best in the conditions ofmaterials-lipid ratio of 1∶10，sample volume of 5 times，separate gel concentration of 15%，which obtained 18 bands totally.CONCLUSIONS：Established protein extraction method and SDS-PAGE technical system are suitable for detecting the purity of A.sinensis seed.

Angelicae sinensis；Seed；Protein extraction；SDS-PAGE

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1751-04

2016-08-27

2016-11-08）

（編輯：劉 萍）

國家中醫藥管理局“國家基本藥物所需中藥材種子種苗繁育基地建設”基金資助項目（No.國中醫藥辦規財發〔2013〕41號）

＊副教授，博士。研究方向：藥用植物育種和組織培養方面的教學和研究。E-mail：zhyh456789@163.com

#通信作者：教授，碩士生導師。研究方向：藥用植物育種的教學和研究。E-mail：gslzdt@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.07