新疆一枝蒿cDNA文庫構(gòu)建方法研究Δ

劉 沖，程 波，何 江，楊偉俊，地力努爾·吐爾遜江，滿爾哈巴·海如拉，薛桂蓬，魏梅梅，王 雪（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所/新疆維吾爾藥重點實驗室，烏魯木齊 830004）

新疆一枝蒿cDNA文庫構(gòu)建方法研究Δ

劉 沖＊，程 波，何 江，楊偉俊#，地力努爾·吐爾遜江，滿爾哈巴·海如拉，薛桂蓬，魏梅梅，王 雪（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所/新疆維吾爾藥重點實驗室，烏魯木齊 830004）

目的：建立構(gòu)建新疆一枝蒿cDNA文庫的方法。方法：采用改良Trizol法提取一枝蒿幼嫩葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，長距離聚合酶鏈反應法（LD-PCR）合成雙鏈cDNA；PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K消化，采用sfiⅠ酶切，酶切產(chǎn)物用CHROMA SPIN-400柱分級分離，回收0.4 kb以上的cDNA，以λTriplE×2噬菌體連接并進行體外蛋白包裝，利用SMART技術(shù)構(gòu)建一枝蒿全長cDNA文庫；隨機挑取文庫中20個單克隆，電泳法測定原始文庫滴度、文庫容量、cDNA插入片段的重組陽性率與大小。結(jié)果：原始文庫滴度為1.94×107pfu/m L，庫容量為0.97×107pfu；cDNA插入片段重組陽性率為96%，大小為0.5～2.0 kb，平均為0.9 kb。結(jié)論：所構(gòu)建的高庫容、高質(zhì)量的文庫可為新疆一枝蒿cDNA文庫的構(gòu)建提供基礎(chǔ)。

新疆；一枝蒿；cDNA文庫；構(gòu)建；功能基因

新疆一枝蒿（Artemisia rupestris L.）為菊科蒿屬多年生草本植物，主要分布于我國新疆，其地上全草是新疆哈薩克醫(yī)學常用藥材。一枝蒿療效確切、應用廣泛，具有清熱解毒、消食健胃、祛風涼血之功效，常用于治療感冒、過敏、食積、蛇傷、瘡癤[1]。民間諺語中記載著“家有一枝蒿，不怕被蛇咬；家有一枝蒿，百病都除掉”[2]。

目前，一枝蒿主要依靠自然繁殖生長，加上無計劃地采挖和過度放牧，其野生資源面臨枯竭。而且一枝蒿有效成分酮酸類化合物結(jié)構(gòu)復雜，人工合成困難。如何使該藥用資源可持續(xù)發(fā)展具有現(xiàn)實意義，而構(gòu)建cDNA文庫是探索藥材相關(guān)功能基因組學的重要手段。文獻報道已經(jīng)成功構(gòu)建了人參[3]、丹參[4]、鐵皮石斛[5]、甘草[6]、滇重樓[7]等藥用植物的cDNA文庫。因此，在本研究中，筆者以野生一枝蒿幼嫩葉片組織為材料，利用SMART（Sw itching Mechanism At5′end of the RNA Transcript）技術(shù)，首次構(gòu)建其幼嫩葉片組織cDNA文庫，為進一步克隆一枝蒿相關(guān)功能基因及代謝途徑研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

TC-512聚合酶鏈反應（PCR）儀（英國Techne公司）；DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一儀器廠）；DOC2000凝膠成像儀（美國Bio-rad公司）；1200紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；BS110S電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥材

一枝蒿葉片于2014年5月采自新疆伊犁哈薩克自治州伊寧縣（E80°33′31.230 0″，N44°10′12.666 0″，當一枝蒿的枝條長出5～10片真葉時開始采集），由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為新疆一枝蒿（Artemisia rupestris L.）全草，雙蒸水清潔后用濾紙吸干水分，迅速放入液氮中，于－80℃冰箱貯存，備用。

1.3 試劑與其他

Trizol試劑、瓊脂糖（美國賽默飛世爾科技公司，批號：15596026、2014101121）；SMARTTMcDNA文庫構(gòu)建試劑盒（cDNA Library Construction Kit）、蛋白測試試劑盒（Advantage2 PCR Kit，美國Clontech公司，批號：2014101121、639206）；核酸分子量標準品DL2000（分子量：750 bp）、T4DNA連接酶均購自大連TaKaRa公司；蛋白酶K、牛血清白蛋白（BSA）均購自上海雅心生物技術(shù)有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、水飽和酚、β-巰基乙醇（BME）均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、冰乙酸等均為分析純；水為雙蒸水。

2 方法

采用改良Trizol法提取一枝蒿幼嫩葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，長距離聚合酶鏈反應法（LD-PCR）合成雙鏈cDNA；PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K消化，采用sfiⅠ酶切；酶切產(chǎn)物用CHROMA SPIN-400柱分級分離，回收0.4 kb以上的cDNA，以λTriplE×2噬菌體連接并進行體外蛋白包裝；利用SMART技術(shù)構(gòu)建一枝蒿全長cDNA文庫并進行質(zhì)量評價，詳細操作如下。

2.1 總RNA提取

稱取一枝蒿葉片組織約100mg，放入經(jīng)預冷的研缽里，在液氮中充分研磨。用改良Trizol法[3]提取一枝蒿葉片總RNA，加入經(jīng)DEPC處理的水20μL以溶解RNA，電泳檢測總RNA純度，－80℃保存，備用。

2.2 單鏈與雙鏈cDNA合成

cDNA雙鏈合成參考cDNA文庫構(gòu)建試劑盒說明書操作。吸取3μL總RNA溶液作模板，以SMARTⅣ寡核苷酸（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′）和CDSⅢ/3′PCR引物[5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d（T）30（N-1）N-3′；N＝A，G，C，or T；N-1＝A，G，or C]作為反應體系引物，在SMART反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成單鏈cDNA。吸取2 μL單鏈cDNA產(chǎn)物作為合成雙鏈cDNA的模板，采用LD-PCR法合成雙鏈cDNA，即以5′PCR引物（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′）和CDSⅢ/3′PCR引物作為體系引物。采用蛋白測試試劑盒合成雙鏈cDNA，反應條件為：95℃20 s；95℃5 s；68℃6min，25個循環(huán)。吸取5μL PCR產(chǎn)物，采用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈cDNA分布情況。

2.3 蛋白酶K消化及sfiⅠ酶切

吸取50μL雙鏈cDNA（約2～3 g），加入2μL蛋白酶K，45℃水浴20min，用酚/氯仿抽提，進一步純化產(chǎn)物，加入水溶解沉淀。然后依次加入10倍sfiⅠ緩沖液10μL、sfiⅠ酶10μL、100×BSA 1μL，充分混合后于50℃孵育2 h，孵育后加入1%二甲苯青2μL，混勻。

2.4 cDNA片段分級分離

將混有1%二甲苯青的cDNA加入到cDNA文庫構(gòu)建試劑盒中的CHROMA SPIN-400分離柱中，待滲入基質(zhì)后加入過柱緩沖液100μL，待自然滲盡后，再加入過柱緩沖液600μL。將預先備好的16個離心管迅速放在柱下方，每管1滴直到緩沖液滴盡為止。每管取3μL上1.1%瓊脂糖凝膠電泳。另取DL2000為對照，于150 V電泳10min，記錄電泳圖。選擇分子量大于0.4 kb的3～4管，收集到新的離心管中，依次加入1/10倍體積（BV）醋酸鈉（3mol/L，pH 4.8）、糖原（20mg/m L）1.3μL、2.5 BV 95%乙醇（－20℃），于－20℃靜置過夜后，離心（離心半徑為6.5 cm，下同，14 000 r/m in）20m in，棄去上清液，加入7μL水溶解沉淀。

2.5 cDNA片段與λTrip lE×2噬菌體的連接與包裝

取滅菌的0.5m L離心管，加入“2.4”項處理后的cDNA1.0μL，依次加入cDNA文庫構(gòu)建試劑盒中的500 ng/μLλTriplE×2噬菌體（Vector）1.0μL、10×連接緩沖液（Ligation buffer）0.5μL、腺苷三磷酸（ATP，10 mmol/L）0.5μL、T4DNA連接酶0.5μL，輕柔混勻，16℃連接過夜。將噬菌體包裝提取物置于冰上解凍，取25μL包裝提取物加入到5μL連接產(chǎn)物中，30℃溫育90m in，再加入25μL溶解后的包裝提取物，30℃溫育90m in后，加入500μL噬菌體稀釋緩沖液，輕柔渦旋混勻；加入25μL氯仿，輕柔渦旋混勻；離心（10 000 r/min）30 s，取上清液，即得包裝混合物，4℃冰箱貯存。

2.6 原始cDNA文庫質(zhì)量評價

從cDNA文庫構(gòu)建試劑盒中挑取一個復活的藍色單菌落，接種于15m L普通培養(yǎng)基（LB）/硫酸鎂（Mg-SO4）/麥芽糖液體培養(yǎng)基中，于37℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，離心（5 000 r/m in）5 m in，棄上清，用7.5 m L 10 mmol/LMgSO4重懸沉淀。準備適量90mm LB/MgSO4瓊脂平板，37℃預熱，分別取“2.5”項下包裝混合物2 μL，共3份，用1×Ligation buffer稀釋，體積比分別為1∶50、1∶500、l∶1 000。取各梯度稀釋液10μL，分別加入200μL重懸菌液，混勻，37℃浸染20m in。將上述培養(yǎng)物加入到3m L 45℃LB/MgSO4/頂層瓊脂（soft）培養(yǎng)基中，迅速混勻，立即倒入37℃預熱的平板上，晃動平板使瓊脂分散均勻，室溫放置10m in以冷卻上層膠。37℃倒置培養(yǎng)6～18 h，定期記錄噬菌斑生長情況并計算文庫滴度。文庫滴度（pfu/m L）＝噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×103（μL/m L）/稀釋噬菌體的鋪板體積（μL）；原始庫容量（pfu）＝文庫滴度（pfu/m L）×連接產(chǎn)物總體積（m L）。培養(yǎng)基中加入異丙基硫代半乳糖苷（100mmol/L）50μL、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（100mmol/L）50μL過夜培養(yǎng)后，隨機挑取20個噬菌斑單克隆，以F（5′-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3′）和R（5′-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3′）為正反引物，PCR檢測其重組陽性率（%，嵌入載體的數(shù)量/總數(shù)量× 100%）與cDNA片段大小。

3 結(jié)果

3.1 總RNA分析

利用改良Trizol法提取一枝蒿葉片總RNA，經(jīng)電泳檢測表明，28 S和18 S的2個條帶清晰，提示總RNA在提取過程中未發(fā)生降解，離散程度較低。這表明提取總RNA的純度較高，符合構(gòu)建cDNA文庫的要求，電泳圖見圖1。

圖1 總RNA電泳結(jié)果Fig 1 Electrophoresis resultsof totalRNA

3.2 雙鏈cDNA的合成分析

雙鏈cDNA經(jīng)電泳檢測分析表明，雙鏈cDNA經(jīng)電泳后形成一條彌散狀條帶，長度在0.1～5 kb范圍內(nèi)，進一步提示mRNA反轉(zhuǎn)錄成功，擴增產(chǎn)物的分子量范圍符合構(gòu)建cDNA文庫的要求。

3.3 雙鏈cDNA經(jīng)sfiⅠ酶切及其分級分離分析

雙鏈cDNA片段經(jīng)過CHROMA SPIN-400分離柱分級分離，共收集到16管分離產(chǎn)物。經(jīng)電泳檢測分析表明，第8～10管cDNA產(chǎn)物片段大小均明顯大于0.4 kb。合并這3管用于進一步試驗，除去其余小分子cDNA片段。分級分離檢驗結(jié)果見圖2。

圖2 分級分離檢驗結(jié)果Fig 2 Classification and fractionation test results

3.4 原始cDNA文庫質(zhì)量評價結(jié)果

原始文庫滴度為1.94×107pfu/m L，原始庫容量為0.97×107pfu。20個噬菌斑單克隆進行菌落PCR檢測，詳見圖3。

圖3 PCR檢測結(jié)果Fig 3 PCR test results

結(jié)果，除1、20單克隆未檢測出條帶，17出現(xiàn)雙目的條帶外，其余均得到了有效擴增。cDNA插入片段重組陽性率為96%，其中最大的cDNA片段約2 kb，最小的約為0.4 kb，cDNA片段大小主要分布在0.5～2.0 kb，0.75 kb片段超過50%，平均長度為0.9 kb左右，表明試驗基本符合構(gòu)建一枝蒿cDNA文庫的要求。

4 討論

在構(gòu)建植物cDNA文庫過程中，RNA純度及其質(zhì)量是試驗中較為重要的環(huán)節(jié)，直接決定著后續(xù)試驗的成功與否。由于同種或異種植物的不同組織中的組分與含量差異較大，因此，提取植物總RNA尚無統(tǒng)一通用的方法。必須針對不同植物材料的特點對提取方法進行選擇性優(yōu)化，才能得到高質(zhì)量核酸[8]。本試驗曾用Trizol法提取一枝蒿葉片總RNA，結(jié)果不理想，故需在原有Trizol法基礎(chǔ)上進一步改良優(yōu)化。因此，筆者采用巰基乙醇作為還原劑，分別用氯仿和水飽和酚抽提、用高濃度鹽溶液進一步沉淀，以去除蛋白質(zhì)、多糖、多酚等雜質(zhì)，最后用無水乙醇沉淀總RNA。最后，獲得的總RNA完整性較好、純度較高，且操作簡單、快速，符合進一步試驗的要求。

通常構(gòu)建cDNA文庫的載體主要以質(zhì)粒和噬菌體為主，質(zhì)粒文庫多適于表達豐度較高的mRNA，其低豐度cDNA克隆數(shù)量相對較少；而噬菌體文庫多適用于表達豐度較低的mRNA，可大大提高低豐度cDNA的克隆數(shù)量。考慮到一枝蒿的某些功能基因可能為低豐度的表達，因此本試驗選擇λTriplE×2噬菌體作為本次構(gòu)建一枝蒿cDNA文庫的載體。一般評價cDNA文庫的質(zhì)量的標準主要是看其原始滴度、重組陽性率以及載體插入cDNA片段的長度[9-10]，原始文庫滴度一般要求不低于106pfu/m L，重組陽性率＞85%以上方為有效文庫。雙鏈cDNA片段經(jīng)過CHROMA SPIN-400柱分級分離，除去0.4 kb以下的小片段，避免了小片段優(yōu)先與載體相連接，大大提高了其相關(guān)基因的完整性。在本試驗中，一枝蒿cDNA文庫原始文庫滴度已達到1.94×107pfu/m L，PCR結(jié)果表明重組陽性率為96%，表明本試驗所構(gòu)建的文庫是一個高庫容、高質(zhì)量的文庫。

一枝蒿主要為新疆哈薩克族民間習用藥材，隨著新疆民族醫(yī)藥被越來越多的人認識和了解，一枝蒿的開發(fā)近年來急劇增長，野生資源已日益枯竭。一枝蒿適宜于中高海拔山地氣候條件，人工栽培多因生態(tài)環(huán)境不適，加之資金、技術(shù)等因素制約，至今未成功實現(xiàn)規(guī)模化種植。另外，隨著一枝蒿的藥理作用被逐步證實，對其化學成分的研究日益受到重視。自本單位最早從一枝蒿中分離得到萜類成分一枝蒿酮酸和異一枝蒿酮酸以來[11-12]，其結(jié)構(gòu)與活性已逐漸受到國內(nèi)外的重視[13]。本研究通過構(gòu)建新疆一枝蒿cDNA文庫，進一步為其克隆、保護相關(guān)功能基因及開發(fā)有效次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

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Study on the cDNA Library Construction M ethod for Xinjiang Artem isia rupestris

LIU Chong，CHENG Bo，HE Jiang，YANGWeijun，DILINUER·Tuerxunjiang，MERHABA·Heyrulla，XUE Guipeng，WEIMeimei，WANG Xue（Xinjiang Institute of Materia Medica/Key Laboratory of Xinjiang Uighur Medicine，Urumqi830004，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for full-length cDNA library of Xinjiang Artemisia rupestris.METHODS：Modified Trizolmethod was adopted to extract total RNA in young leaves of A.rupestris，itwas transcribed into single-strand cDNA，and then synthesized into double-strand cDNA by long-distance polymerase chain reaction（LD-PCR）method.PCR productwas digested by proteinase K and sfiⅠ，and then fractionated by CHROMA SPIN-400 columns.The cDNA longer than 0.4 kb were collected and ligated to phageλTriplE×2，and then protein packaging was performed.Full-length cDNA library was established by SMART technology.20monoclonalwere random ly selected from the library，and electrophoresiswas used to determine the primary library titer，library capacity，recombinant positive rate and length of insert cDNA.RESULTS：The primary library titer was 1.94× 107pfu/m L，library capacity was 0.97×107pfu；recombinant positive rate of insert cDNA was 96%and length was 0.5-2.0 kb w ith an average of 0.9 kb.CONCLUSIONS：The established library is high in capacity and quality，which can provide basis for establishing cDNA library of Xinjiang A.rupestris.

Xinjiang；Arternisia rupestris；cDNA library；Construction；Functional gene

R282.5

A

1001-0408（2017）13-1793-04

2016-08-10

2017-01-03）

（編輯：劉明偉）

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費資助項目（No.KY2015121）；新疆維吾爾自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目（No.2013721034）

＊副研究員，博士研究生。研究方向：藥用植物資源與利用。E-mail：liu_chong02@163.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：維吾爾藥資源。E-mail：w ilfred3106@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.19