均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化附子中多糖的超聲提取工藝Δ

魯 靜，牛曉靜（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000）

均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化附子中多糖的超聲提取工藝Δ

魯 靜＊，牛曉靜（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000）

目的：優(yōu)化超聲法提取附子中多糖的工藝。方法：采用均勻設(shè)計(jì)法，考察液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)附子多糖提取率的影響，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)并與常規(guī)煎煮法結(jié)果比較。結(jié)果：優(yōu)化的超聲提取工藝為液料比10m L/g、超聲時(shí)間34min、超聲溫度73℃；驗(yàn)證試驗(yàn)中多糖提取率為19.05%（RSD＝0.60%，n＝3），與預(yù)測值（19.44%）的相對(duì)誤差為2.0%，提取率高于煎煮法的16.42%。結(jié)論：優(yōu)化的超聲提取工藝簡單、快速、穩(wěn)定，且提取率較高，適用于附子中多糖的提取。

附子；多糖；超聲提取；工藝優(yōu)化；均勻設(shè)計(jì)法

附子是毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根，味辛甘，性熱，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有回陽救逆、散寒除濕的功效，主治陰盛格陽、大汗亡陽、吐瀉厥逆、心腹冷痛等[1]。由于附子毒性較大，臨床上常以其炮制品入藥，根據(jù)加工方式的不同，可分為鹽附子、黑順片、白附片、淡附片等，其中黑順片的臨床使用頻率較高[2]。目前，對(duì)附子成分的研究多集中在生物堿[3]，而關(guān)于附子多糖的報(bào)道相對(duì)較少。附子多糖作為附子有效成分之一，已證實(shí)的生物活性涉及免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護(hù)心肌、降血糖等多個(gè)方面[4-7]，具有一定的研究價(jià)值。

附子多糖的提取方法主要有煎煮法、熱水浸提法、微波提取法等[8-10]。煎煮法和熱水浸提法所需時(shí)間較長，而微波提取設(shè)備不易普及。超聲提取法具有操作簡單、提取時(shí)間短、提取率高、對(duì)成分影響小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中藥有效成分的提取[11-12]。為了更加有效地提取附子多糖，本試驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)附子超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為附子多糖的有效利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；LXJ-IIB型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FW-500型高速萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

D-無水葡萄糖（以下簡稱葡萄糖）對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-200503，含量：以99.5%計(jì)）；蒽酮、無水乙醇、濃硫酸等均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

黑順片（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：151203）由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭的子根。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖的含量測定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品10.80mg，用水溶解并定容至100m L量瓶中，搖勻，制成質(zhì)量濃度為108.0μg/m L的葡萄糖對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黑順片粉末10 g，精密稱定，加入80%乙醇適量過夜，回流提取3 h脫脂，藥渣揮干后，加入一定體積的水，按照設(shè)定的超聲條件提取；過濾，濾液濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，搖勻，4℃放置24 h，離心（4 000 r/m in，20m in，離心半徑為20 cm）；棄去上清液，沉淀用水溶解，轉(zhuǎn)移并定容至1 000m L量瓶中，搖勻，再精密移取8m L，用水稀釋并定容至250 m L量瓶中，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m L，置于10m L具塞刻度試管中，加水至2m L，搖勻；迅速精密加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6m L，混勻后于沸水浴中加熱15min，取出，立即置于冰水浴中冷卻15min，取出。以相應(yīng)的試劑為空白，在625 nm波長處測定吸光度（A）。以A為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程為：A＝43.363c+0.036 44（R2＝0.999 4）。結(jié)果表明葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.7～18.9μg/m L。

2.1.4 精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按相關(guān)方法進(jìn)行操作。結(jié)果精密度試驗(yàn)中吸光度的RSD為0.41%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗(yàn)中供試品溶液在放置90m in內(nèi)吸光度的RSD為0.78%（n＝6）；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中平均加樣回收率為99.4%（RSD＝2.06%，n＝9）。

2.1.5 樣品含量測定 精密量取供試品溶液2m L，置于10m L具塞刻度試管，搖勻，迅速精密加入新制備的0.1%蒽酮-硫酸溶液6m L，其余操作同“2.1.3”項(xiàng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算供試品溶液中多糖含量。

2.2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇液料比（X1）、超聲時(shí)間（X2）、超聲溫度（X3）為考察因素，以附子多糖提取率（Y，多糖提取率＝供試品溶液中多糖質(zhì)量濃度×供試品溶液總體積/藥材質(zhì)量×100%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)因素設(shè)置8個(gè)水平，選用均勻設(shè)計(jì)表U8*（83）設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。稱取黑順片粉末8份，每份約10 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，測定樣品中多糖含量，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。均勻試驗(yàn)的因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factorsand levels

表2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and resultsof uniform test

利用SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸分析處理，得到Y(jié)與X1、X2、X3的回歸方程為：Y＝5.030 9－0.235 9X2+0.004 5X1X2－0.002 1X1X3+0.003 3X2X3+0.002 7X32（R＝0.992）。調(diào)整后R2＝0.946，P＝0.038＜0.05，表明回歸方程擬合度高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各因素對(duì)Y的影響大小為：X32（P＝0.030）＞X1X2（P＝0.079）＞X1X3（P＝0.114）＞X2X3（P＝0.159）＞X2（P＝0.165）。X1與X2、X1與X3、X2與X3存在交互作用：X2、X1X3的系數(shù)為負(fù)值，提示其與Y呈負(fù)相關(guān)；X1X2、X2X3、X32的系數(shù)為正值，提示其與Y呈正相關(guān)。

將回歸方程進(jìn)行規(guī)劃求解，Y值大者為佳，得到附子多糖最優(yōu)提取條件為液料比10m L/g、超聲時(shí)間34m in，超聲溫度73℃，此時(shí)Y預(yù)測值為19.44%。

2.3 工藝驗(yàn)證

取黑順片粉末50 g，精密稱定，共3份，按上述最優(yōu)提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。得多糖提取率分別為18.92%、19.08%、19.14%，平均值為19.05%（RSD＝0.60%，n＝3），與預(yù)測值接近，相對(duì)誤差為2.0%，提示回歸方程預(yù)測基本準(zhǔn)確，優(yōu)化后的試驗(yàn)條件可靠，結(jié)果重現(xiàn)性好。

2.4 與煎煮法比較

煎煮法方法參考文獻(xiàn)[8]。取黑順片粉末50 g，精密稱定，脫脂后加入10倍量的水，煎煮2次，每次2 h；過濾，合并濾液，濃縮至適量，其余按“2.1.2”項(xiàng)下自“加入4倍量體積無水乙醇”起操作，按“2.1.5”項(xiàng)下方法測定，測得多糖提取率為16.42%（n＝3）。結(jié)果表明，超聲法提取附子多糖的提取率要高于煎煮法。

3 討論

超聲法是近年來應(yīng)用于中藥有效成分提取分離的較為成熟的技術(shù)，主要通過超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)等[13]促進(jìn)中藥有效成分進(jìn)入溶劑。該方法具有簡便、快速、高效、節(jié)能等特點(diǎn)。目前，國內(nèi)外利用超聲法提取中藥有效成分的報(bào)道屢見不鮮，涉及絕大部分中藥的多個(gè)種類的活性成分，提取方法已收錄至多版《中國藥典》中，用于制備樣品以進(jìn)行目標(biāo)成分的鑒定或含量測定。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和對(duì)超聲提取工業(yè)化設(shè)備的探索研究，循環(huán)超聲提取機(jī)、超聲逆流循環(huán)提取機(jī)已研發(fā)成功并適用于揮發(fā)性或非揮發(fā)性溶劑提取有效成分。中試型超聲提取機(jī)提取葛根素的研究已見報(bào)道，單次可提取葛根0.5 kg[14]。超聲波強(qiáng)化逆流提取機(jī)的開發(fā)，滿足了藥材提取物生產(chǎn)的工藝要求，產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)效益得到大幅度提高，有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[15]。因此，超聲法在中藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和開發(fā)價(jià)值。附子多糖的提取目前多采用煎煮或熱水浸提，提取時(shí)間長（約4 h）。而本試驗(yàn)建立的附子多糖的超聲提取法，方法操作簡單，不僅提取時(shí)間較傳統(tǒng)方法縮短80%（34min vs.4 h）以上，且提取率較高。

當(dāng)試驗(yàn)所研究的因素和水平數(shù)較多時(shí)，均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)比其他設(shè)計(jì)法需要更少的試驗(yàn)次數(shù)，且能夠反映因素之間的交互作用，具有明顯的優(yōu)越性。設(shè)計(jì)時(shí)要求試驗(yàn)點(diǎn)在整個(gè)區(qū)域內(nèi)分布均勻，水平范圍應(yīng)盡可能選擇更大，得到的結(jié)果才具有較好的代表性；若試驗(yàn)范圍太小，不容易獲得比已有條件有顯著改善的結(jié)果。本試驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)對(duì)超聲提取附子多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，文獻(xiàn)中提取植物多糖的液料比多在5～100m L/g[16-17]，筆者考慮到液料比較小時(shí)多糖提取可能不完全，過大時(shí)超聲波輻射又會(huì)被溶劑大量吸收，不但可影響多糖提取率，且易造成浪費(fèi)，故結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定液料比為10～80m L/g。對(duì)提取溫度的選擇，依據(jù)均勻設(shè)計(jì)法的要求，設(shè)定相對(duì)較大的水平范圍為10～80℃。結(jié)果表明，液料比、超聲時(shí)間、超聲時(shí)間3個(gè)因素存在交互作用；最優(yōu)提取條件下，附子多糖的提取率與預(yù)測值相符。故本文建立的提取方法準(zhǔn)確、可靠，為附子多糖的深入研究和開發(fā)利用提供了科學(xué)的研究基礎(chǔ)。

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典：上冊[M].2版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2005：1670-1674.

[2] 羅學(xué)鳳.淺談黑順片的合理應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014，33（11）：48.

[3] 陳思，李武宏，陳嘯飛，等.附子生物堿化學(xué)成分和質(zhì)量控制的研究進(jìn)展[J].藥物分析雜志，2014，34（10）：1709-1717.

[4] 李發(fā)勝，徐恒瑰，李明陽，等.附子多糖的提取及免疫活性研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35（12）：2290-2291.

[5] 高林林，曾升平，潘力弢.附子多糖誘導(dǎo)肝癌患者外周血樹突狀細(xì)胞分化成熟的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國腫瘤臨床，2012，39（13）：882-885，894.

[6] 劉穎，紀(jì)超.附子多糖對(duì)SD乳鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23（5）：504-507.

[7] 于樂，吳偉康.附子多糖對(duì)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型GLUT4蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)位的影響[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2014，14（7）：856-858.

[8] 葉強(qiáng)，張丹，郭力.附子多糖提取純化工藝研究[J].中藥與臨床，2013，4（2）：29-31.

[9] 朱盛林，鄭玲利，袁明勇，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化附子多糖的微波提取工藝[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（16）：48-51.

[10] 舒曉燕，劉慧，梁靜，等.川附子粗多糖提取工藝的研究[J].中藥材，2006，29（12）：1349-1352.

[11] 曹建華，李光輝，張敏.超聲波輔助提取藍(lán)莓總黃酮的工藝優(yōu)化[J].中國藥房，2015，26（31）：4426-4428.

[12] Lin L，NiB，Lin H，etal.Simultaneous determ ination of 14 constituents of Radix polygonimultiflori from different geographical areas by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Biomed Chromatogr，2015，29（7）：1048-1055.

[13] 萬水昌，王志祥，樂龍，等.超聲提取技術(shù)在中藥及天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23（1）：60-62.

[14] 曾榮華，李金華，劉翠紅.多功能超聲波提取機(jī)強(qiáng)化提取葛根素的研究[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2007，2（16）：1-2.

[15] 易克傳，岳鵬翔，王繼先，等.超聲波強(qiáng)化逆流提取機(jī)及提取試驗(yàn)[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2007，38（12）：109-112.

[16] 朱智勇.超聲提取白花蛇舌草多糖的工藝研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010，29（14）：43.

[17] 胡位榮，孫茹，李昭露，等.霸王花水溶性多糖提取工藝及其對(duì)羥自由基的清除作用[J].食品科學(xué)，2013，34（14）：104-107.

Optim ization of Ultrasonic Extraction Technology for Polysaccharide from Aconiti Lateralis Radix Praeparata by Uniform Design M ethod

LU Jing，NIU Xiaojing（Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To optim ize ultrasonic extraction technology for polysaccharide from Aconiti lateralis radix praeparata（ALRP）.METHODS：Uniform design method was applied to investigate the effects of liquid material ratio，ultrasonic time and ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharide from ALRP.Verification test was conducted and compared w ith the results of conventional decoction and boiling method.RESULTS：Optim ized ultrasonic extraction technology was as follow as liquid material ratio of 10m L/g，ultrasonic time of 34min and ultrasonic temperature of 73℃.The polysaccharide extraction rate in verification test was 19.05%（RSD＝0.60%，n＝3），relative error of the predicted value（19.44%）was 2.0%，while the extraction rate was higher than decoction and boiling method（16.42%）.CONCLUSIONS：Optimized ultrasonic extraction technology is simple，rapid and stable w ith high extraction rate，which is suitable for extracting polysaccharide from ALRP.

Aconiti lateralis radix praeparata；Polysaccharide；Ultrasonic extraction；Technology optim ization；Uniform design method

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1834-03

2016-08-22

2016-09-24）

（編輯：劉 萍）

河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研基金項(xiàng)目（No.2012KJ31）

＊主管藥師，博士。研究方向：藥物分析。電話：0371-66251204。E-mail：lujing1@msn.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.30