水稻脫落酸響應基因分析

樊凌志，季科研，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

水稻脫落酸響應基因分析

樊凌志，季科研，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

脫落酸（ABA）參與調節植物的生長和發育，在植物抗擊外界環境壓力方面起到了重要的作用。為了篩選出水稻體內的脫落酸響應基因，試驗設計了OsRD22，OsLTP4，OsLEA7的定量PCR引物，同時利用以終濃度為50 μmol/L的外源脫落酸處理的水稻葉片為材料，分析3種基因對外源脫落酸的響應情況。結果表明，隨著外源脫落酸處理時間的延長，OsLTP4，OsLEA7等2種基因的相對轉錄水平并沒有隨之增長；OsRD22基因的相對轉錄水平隨著時間的增加，呈現出表達量逐漸升高的趨勢。因此，基因OsRD22的表達水平可以作為測定水稻葉片內脫落酸相對含量的指標。

脫酸酸；水稻；相對轉錄水平；RT-PCR

水稻是世界上最重要的主食作物之一，其提供和保證了熱帶、亞熱帶以及亞洲的近30億人每日的能量攝入。近幾年，水稻作為單子葉植物是研究先天免疫的關鍵模型[1]；而在植物激素方面，特別是激素在水稻防御機制中的作用方面研究卻很少。

ABA參與植物生長發育許多方面的調節，包括種子發芽、胚胎成熟、葉衰老、氣孔孔徑和對外界環境脅迫的適應。因此，ABA在植物防御反應中起重要作用[2]。在不同類型的植物—病原體相互作用中，ABA通常參與植物對各種生物營養和壞死性病原體防御的負調節：ABA主要通過引發胼質體的沉積誘導抗性[3]。HERNANDEZ-BLANCO等[4]提供了ABA信號直接參與控制擬南芥R.solanacearum抗性的證據：在影響次級細胞壁形成所需的纖維素合酶基因的擬南芥突變體中，對響應ABA防御相關基因的誘導明顯增加。表明ABA可以通過調節擬南芥中的細胞壁代謝來發揮其對植物的防御作用。同時，在擬南芥中，ABA響應基因包括RD22，LTP4，LEA7基因，相對轉錄水平都受到外源脫落酸的調節，并且在外源處理擬南芥42 d后，LEA7的相對轉錄水平是野生型的60倍[5-7]。

本研究以日本晴為材料、擬南芥的內源ABA響應基因[8]為模板，比對水稻的同源基因，通過加入外源ABA處理水稻，探討水稻體內3種基因（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）表達量，分析脫落酸與這3個基因表達的相關性，篩選水稻內源ABA的響應基因。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗以日本晴種子為材料。

1.2 方法

1.2.1 培養條件種子經消毒劑（10%的次氯酸鈉）處理后，用無菌水漂洗4次，隨即放于37℃培養箱進行萌發，3～4 d后取露白種子置于96孔板中，轉入光照培養箱中進行水培（28℃/26℃，14/10 h）。三葉期后，用已配制好的新鮮水培培養液（3.3 mmol/L硫酸鹽半培養液）培養7 d，轉用3.3 mmol/L全培養液繼續培養7 d。

1.2.2 水稻脫落酸（ABA）響應基因的對比和引物篩選以擬南芥中脫落酸響應基因AtRD22，AtLTP4，AtLEA7的蛋白質序列為模板，通過BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行比對，獲得水稻粳稻OsRD22，OsLTP4，OsLEA7的蛋白質和DNA序列，利用primers 5軟件設計3種基因的相應引物，經RT-PCR溶解曲線峰檢測引物特異性，從而篩選出特異性引物（表1）。

表1 RT-PCR引物

1.2.3 水稻葉片總RNA提取和cDNA逆轉錄合成

14 d幼苗經外源脫落酸（50 μmol/L）處理不同時間后，剪取水稻葉片（0.2 g）放置于研缽中，加入液氮，研磨充分至粉末，利用Trizol法[9]提取水稻葉片的總RNA，測量濃度后，將RNA置于65℃的水浴鍋中變性5 min，按照表2中列出的試劑逐一加入，水浴37℃15 min，98℃5 min，反應結束后存放于-20℃。

表2 逆轉錄反應體系（20 μL）

1.2.4 RT-PCR篩選響應基因用設備ABI7500，采用20 μL反應體系，按照表3逐一加入相應的定量試劑（Toyobo）。擴增條件設置為：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環。以水稻基因作為內參，并采用2-ΔΔCt法進行定量分析。

表3 RT-PCR反應體系（20 μL）

2 結果與分析

2.1 蛋白質同源性比對

通過對擬南芥中ABA響應基因蛋白質的氨基酸序列進行比對，結果顯示，擬南芥ABA響應基因RD22蛋白序列與水稻同源類似物（XM_015772750.1，XM_015775371.1，XM_015763238.1）的氨基酸序列相似度分別為33%，57%和51%。

2.2 OsRD22轉錄表達分析

經外源脫落酸（終濃度50 μmol/L）處理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻葉片中OsRD22的相對轉錄水平，結果發現，隨著脫落酸處理時間的延長，其相對轉錄量逐漸增多（圖1），處理24 h后其相對轉錄量是對照的55.7倍。

2.3 OsLEA7轉錄表達分析

經外源脫落酸（終濃度50 μmol/L）處理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻葉片中OsLEA7的相對轉錄水平，結果發現，隨著脫落酸處理時間的延長，相對轉錄表達的水平并沒有發現任何規律性變化，0～12 h內，隨著處理時間的延長，表達量逐漸降低；但是在24 h時，表達量是0 h的12倍（圖2）。

2.4 OsLTP4轉錄表達分析

經外源脫落酸（終濃度50 μmol/L）處理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻葉片中OsLTP4的相對轉錄水平，結果發現，隨著脫落酸處理時間的延長，相對轉錄表達的水平并沒有發現任何規律，0～6 h內，隨著處理時間的延長，相對表達量逐漸升高；6～24 h內，隨著處理時間的延長，相對表達量先降低后又升高（圖3）。

3 討論

許多非生物脅迫伴隨著干燥和滲透壓的不平衡，最常見的一種對環境逆境的反應是脫落酸（ABA）水平的短暫上升。ABA的合成會觸發多種防御措施，包括氣孔閉合和大量應激反應基因的激活，在感染后，植物會產生高度特異性的激素報警信號混合物，導致不同的攻擊者特異性免疫應答的激活[10]。近年來，植物生長調節劑被認為在改善植物逆境受損方面具有一定作用，可提高作物的產量和質量[11-12]。ABA參與植物生長和發育許多方面的調節，包括種子發芽、胚胎成熟、葉衰老、氣孔孔徑和對環境脅迫的適應。最近有研究表明[13]，ABA在植物防御反應中起重要作用。

在擬南芥中，ABA響應基因包括RD22，LTP4， LEA7基因，相對轉錄水平都受到外源脫落酸的調節，并且在外源處理擬南芥42 d后，LEA7的相對轉錄水平是野生型的60倍，擬南芥的脫落酸響應基因AtRD22，AtLTP4，AtLEA7蛋白序列與水稻中3種蛋白序列OsRD22，OsLTP4，OsLEA7相似度分別為33%，57%和51%。

為了分析水稻脫落酸的響應基因，本研究選擇了OsRD22，OsLTP4，OsLEA7為目標基因，分析了外源脫落酸對3種基因相對表達量的影響，結果發現，經50 μmol/L外源脫落酸處理，可提高水稻葉片中OsRD22的表達，隨著外源脫落酸處理時間的增長，OsLTP4，OsLEA7等2種基因的相對轉錄水平并沒有隨之增長。利用定量PCR的方法分析水稻葉片中OsRD22的相對轉錄水平，結果發現，隨著脫落酸處理時間的延長，其相對轉錄量逐漸增多，處理24 h后其相對表達量是對照的55.7倍；0～12 h內，隨著處理時間的延長，OsLTEA7的相對表達量逐漸降低，但是在24 h時相對表達量是0 h的12倍；隨著脫落酸處理時間的延長，OsLTP4相對轉錄表達的水平沒有發現任何規律。

OsRD22對脫落酸的相對轉錄表達水平的響應，與擬南芥同源蛋白的表達調控一致。脫落酸在植物的生長發育水平方面發揮著不可或缺的作用，參與調控植物抗生物及非生物脅迫的過程。本研究分析了外源脫落酸對3種基因（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）的響應及敏感程度，結果發現，OsRD22是脫落酸的正相關基因。因此，推測可以利用OsRD22的相對轉錄水平反映水稻內源脫落酸的相對含量。

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Analysis of Abscisic Acid Response Gene in Rice

FANLingzhi，JI Keyan，PUShoucheng，SUNMeihao
（College ofChemistry＆Life Science，ZhejiangNormal University，Jinhua 321004，China）

Abscisic acid is the regulator in the plant growth and development,which plays vital roles in plant developments and dealing with biotic and abiotic stresses.To analyze rice marker genes for abscisic acid,three genes（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）were selected,and their relative transcription levels were studies by quantitative PCR（qPCR）using rice leaves treated with abscisic acid（50 μmol/L）.Results of qPCR demonstrated that transcription of OsLTP4 and OsLEA7 were not upregulated by abscisic acid.On the contrary,the transcription of OsRD22 was upregulated by abscisic acid.So as the result,we proposed that the relative transcription levels ofOsRD22 could be used toindicate relative levels ofactive abscisic acid in rice leaves.

abscisic acid;rice;relative transcription levels;RT-PCR

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.04

S511

：A

：1002-2481（2017）05-0689-04

2017-01-20

國家自然科學基金項目（31070055）；浙江省本科院校中青年學科帶頭人學術攀登項目（pd2013060）

樊凌志（1991-），女，山西晉中人，在讀碩士，研究方向：蛋白質結構與功能。孫梅好為通信作者。