槲皮素改善大鼠骨髓來源內皮祖細胞生物學功能及其機制研究*

蔣璐璐, 楊娜娜, 陳巧睿, 高 翔, 姚樹桐， 王大新, 秦樹存△

(1中南大學湘雅二醫院心血管內科，湖南 長沙 410011； 2泰山醫學院動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，山東 泰安 271000；3江蘇省蘇北人民醫院心血管內科，江蘇 揚州 225001)

槲皮素改善大鼠骨髓來源內皮祖細胞生物學功能及其機制研究*

蔣璐璐1,3, 楊娜娜2▲, 陳巧睿2, 高 翔2, 姚樹桐2， 王大新3△, 秦樹存2△

(1中南大學湘雅二醫院心血管內科，湖南 長沙 410011；2泰山醫學院動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室，山東 泰安 271000；3江蘇省蘇北人民醫院心血管內科，江蘇 揚州 225001)

目的： 探討槲皮素(quercetin，QUE)對大鼠骨髓來源內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)生物學功能的影響與機制。方法: 密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個核細胞，條件培養基EGM-2誘導分化后，進行雙熒光染色及免疫表型鑒定。將培養14 d的細胞用PI3K抑制劑BYL719(3 μmol/L)和ERK抑制劑FR180204(15 μmol/L)預處理2 h后，再加入不同濃度QUE(0、10、20、40、80和100 μmol/L)處理。MTT法檢測細胞活力，Transwell法檢測細胞遷移，Western blot法檢測AKT、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和ERK蛋白表達及磷酸化水平。結果: QUE呈濃度依賴性提高EPCs活力，促進EPCs遷移；PI3K抑制劑BYL719能抑制QUE誘導的EPCs活力和遷移能力，ERK抑制劑FR180204能抑制QUE誘導的EPCs活力，而對EPCs遷移能力并沒有影響。QUE能激活AKT、eNOS和ERK蛋白；BYL719能同時抑制AKT和ERK蛋白的激活，FR180204僅能抑制ERK的激活，而未能抑制AKT的激活，但兩者對QUE誘導的eNOS蛋白表達均有抑制作用。結論: QUE能部分通過PI3K/AKT/eNOS和ERK/eNOS信號轉導通路，提高EPCs活力及遷移能力，促進EPCs發揮心血管保護作用。

槲皮素； 內皮祖細胞； 內皮型一氧化氮合酶

血管內皮細胞位于血管內膜。如果內皮細胞受損，內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作為其前體細胞，能夠從外周組織或骨髓動員至外周血，遷移、歸巢到受損部位，促進血管壁內皮的損傷修復[1]。內皮細胞功能障礙和損傷修復之間的動態平衡在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發生發展中起重要作用[2]。EPCs修復受損內皮的機制與其增殖、遷移、血管生成等生物學功能有關[3]。研究發現，有心血管疾病危險因素的患者，如高血壓、高血糖、高血脂，其體內EPCs的數量和功能均有所下降[4-5]。因此，提高EPCs功能將有助于修復血管內皮損傷，從而抑制AS的發生發展。

近年來，植物黃酮類作為一類潛在的預防和治療心血管疾病的藥物受到了許多關注。其中，槲皮素(quercetin，QUE)是一種普遍存在于水果、蔬菜和堅果內的黃酮醇，例如蘋果、葡萄和洋蔥等，具有抗氧化、抗炎、免疫調節、抗癌和抗菌、抗病毒等多種生物學活性[6]。最近，QUE對心血管疾病的保護和治療價值被普遍認可。連續2周給予AS模型ApoE-/-小鼠QUE (50 mg·kg-1·d-1)，能阻礙泡沫細胞的形成，減少AS形成過程中氧化和炎癥反應[7]。我們近期研究發現QUE可提高EPCs的細胞活力，但對其機制并不清楚，也未有相關報道，在此本文探討QUE對EPCs增殖和遷移生物學功能及其機制的作用。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

SPF級雄性大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；纖維連接蛋白(BD)；大鼠骨髓單個核細胞分離液(TBD)；EBM-2培養基(Lonza)；M199培養基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1(BT)；兔單克隆CD133抗體(Novus)；兔多克隆FLK-1抗體(Abcam)；抗兔FITC免疫熒光染色試劑盒(Beyotime)；QUE(Sigma)；MTT試劑(Solarbio)；DMSO(Amresco)；Transwell小室(Costar)；DAPI(Roche)；抗β-actin、AKT和p-AKT抗體均購自Sigma；抗內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)抗體(Abcam)；抗p-eNOS抗體(Millipore)；抗ERK和p-ERK抗體(Santa Cruz)；BYL719(Selleck)；FR180204(Cayman)；PVDF膜(Millipore)；ECL(Pierce)。

2 方法

2.1 大鼠骨髓來源EPCs的分離培養 4～6周齡大鼠10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后頸椎脫臼處死，浸泡于75%乙醇10 min。剪取股骨和脛骨，用冷PBS反復沖洗骨髓腔，直至沖洗液清亮；再反復吹打沖洗液，直至沖洗液混勻，經100 μm濾網過濾后加到等體積的單個核細胞分離液上，3 500 r/min離心30 min；吸取中間乳白色云霧狀單個核細胞層，用PBS洗滌細胞沉淀2次后，加入含15%胎牛血清的條件培養基EGM-2重懸細胞，以1×106/cm2細胞密度接種于包被了纖維連接蛋白的培養瓶中。3 d后去除非貼壁細胞，更換新的培養基繼續培養。

2.2 EPCs吸附Ac-LDL和結合UEA-1試驗 將培養7 d 后的EPCs接種于鋪有纖維連接蛋白的蓋玻片上，加入DiI-Ac-LDL(2.5 g/L)，37 ℃孵育2 h；2%多聚甲醛固定5 min后，經PBS潤洗3次，每次5 min；再加入FITC-UEA-1(10 mg/L)，37 ℃孵育1 h后，PBS潤洗3次，每次5 min；用抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，顯紅色熒光的為吸附Ac-LDL的EPCs，顯綠色熒光的為結合UEA-1的EPCs，雙陽性細胞為正在分化的EPCs。

2.3 EPCs表面標志免疫熒光染色 將培養14 d的EPCs接種于蓋玻片，用固定液室溫下固定15 min，經PBS潤洗5 min、3次，加入封閉液在水平搖床上輕搖1 h；然后分別加入 I 抗CD133和FLK-1在4 ℃下過夜，PBS潤洗5 min×3次；最后加入FITC標記抗兔 II 抗室溫下輕搖1 h，PBS潤洗5 min×3次；DAPI染色10 min后，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察，CD133+FLK-1+EPCs顯綠色熒光。

2.4 MTT檢測細胞活力 誘導分化14 d的細胞，胰酶消化后接種在96孔板內，平均每孔接種5 000個細胞。饑餓處理后，加入PI3K抑制劑BYL719(3 μmol/L)和ERK抑制劑FR180204(15 μmol/L)2 h后，再加入不同濃度QUE(0、10、20、40、80、100 μmol/L)處理24 h。之后每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，37 ℃孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，搖床震蕩搖勻10 min，酶標儀490 nm處測定吸光度，以0 μmol/L QUE組的細胞活力為1。

2.5 Transwell檢測細胞遷移 誘導分化14 d的細胞，胰酶消化后接種于6孔板中。饑餓處理后，加入PI3K抑制劑BYL719(3 μmol/L)和ERK抑制劑FR180204(15 μmol/L)2 h后，再加入不同濃度 QUE(0、10、20、40、80、100 μmol/L)處理6 h。經胰酶消化，M199重懸調整細胞密度為1.5×108/L，取100 μL細胞接種于Transwell小室上室，下室加入條件培養基EGM-2誘導細胞遷移。37℃細胞培養箱孵育36 h后，取出小室，用棉簽擦去小室內細胞，下層細胞經冰乙醇固定后，DAPI室溫染色10 min，PBS潤洗3次，每次5 min，在熒光顯微鏡下觀察遷移細胞數。

2.6 Western blot法檢測蛋白表達 誘導分化14 d的細胞，胰酶消化后接種于6孔板中，加入PI3K抑制劑BYL719 (3 μmol/L)和ERK抑制劑FR180204 (15 μmol/L)2 h后，再加入不同濃度QUE(0、40、80、100 μmol/L)處理，在不同時點提取蛋白。經BCA蛋白定量后，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min。電泳后轉印至PVDF膜上，經封閉、 I 抗和 II 抗孵育后，檢測AKT、eNOS、ERK及其磷酸化蛋白的表達情況。

3 統計學處理

每組實驗重復3次以上，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，所有數據均用SPSS 18.0進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 EPCs的培養與鑒定

誘導分化培養4 d的EPCs呈克隆樣生長，克隆內部細胞呈鋪路石樣，周邊細胞呈針樣；傳代后細胞成梭形，吸附低密度脂蛋白和結合凝集素試驗結果顯示，約80%細胞既能吸附Ac-LDL又能結合UEA-1，為正在分化的EPCs；免疫熒光染色發現EPCs表面表達CD133和FLK-1；且這些誘導分化的細胞在體外無臍靜脈內皮細胞情況下能成血管，從而證明所誘導分化的細胞為晚期EPCs，見圖1。

Figure 1.Culture and identification of EPCs derived from rat bone marrow. A: EPCs showing a cobblestone-like morphology cultured for 4 d in EGM-2 medium; B: EPCs exhibiting a fusiform morphology after passage; C: EPCs taking DiI-ac-LDL; D: EPCs binding FITC-UEA-1; E: EPCs expressing surface marker CD133; F:EPCs expressing surface marker FLK-1； G: EPCs forming capillary-like sprouts on Matrigel. The scale bar=50 μm.

圖1 大鼠骨髓來源EPCs的培養與鑒定

2 QUE對EPCs活力的影響

MTT實驗檢測發現，QUE呈濃度依賴性提高EPCs活力。低劑量組(10和20 μmol/L)與對照組比較，差異無統計學顯著性；40、80和100 μmol/L QUE能明顯提高EPCs活力(P<0.01)，尤以100 μmol/L QUE組最為明顯，見圖2。

3 QUE對EPCs遷移能力的影響

如圖3所示，在一定范圍內，QUE呈濃度依賴性促進EPCs遷移，與對照組相比，20 μmol/L QUE組能提高EPCs的遷移能力(P<0.05)，40、80和100 μmol/L QUE組EPCs遷移能力明顯升高(P<0.01)，尤以80 μmol/L QUE組最為明顯。

Figure 2.The effects of QUE on the viability of EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2 QUE對EPCs活力的影響

Figure 3.The effects of QUE on the migration of EPCs. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3 QUE對EPCs遷移能力的影響

4 PI3K抑制劑BYL719和ERK抑制劑FR180204抑制QUE誘導的EPCs活力

結果顯示，100 μmol/L QUE處理細胞24 h，細胞活力較對照組升高(P<0.01)；而給予PI3K抑制劑BYL719和ERK抑制劑FR180204預處理，則顯著降低QUE誘導的細胞活力(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The improvement of viability of EPCs induced by QUE was inhibited by PI3K inhibitor (BYL719) and ERK inhibitor (FR180204). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsQUE group.

圖4 BYL719和FR10204抑制QUE誘導的EPCs活力增強

5 PI3K抑制劑BYL719抑制QUE誘導的EPCs遷移能力

與對照組相比，80 μmol/L QUE明顯提高EPCs遷移能力(P<0.01)，給予PI3K抑制劑BYL719處理，顯著抑制QUE誘導的EPCs遷移能力增強(P<0.01)；ERK抑制劑FR180204不能阻斷QUE的這種作用，見圖5。

6 QUE在不同時點對AKT、eNOS和ERK活化的影響

與對照組比較，QUE在5 min和15 min時能激活p-AKT表達(P<0.05)，在30 min和60 min時顯著上調p-AKT蛋白水平(P<0.01)，尤以30 min組最為明顯；且在60 min時能明顯上調eNOS蛋白表達和磷酸化水平(P<0.01)；同時QUE在30 min時可明顯升高p-ERK蛋白水平(P<0.01)，見圖6。

7 不同濃度QUE對AKT、eNOS和ERK活化的影響

如圖7所示，與對照組相比，QUE呈濃度依賴性升高AKT和ERK蛋白磷酸化水平(P<0.01)， 100μmol/L組能顯著提高eNOS蛋白的表達和磷酸化水平(P<0.01)。

Figure 5.The ability of migration of EPCs enhanced by QUE was inhibited by PI3K inhibitor (BYL719). The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsQUE group.

圖5 BYL719抑制QUE誘導的EPCs遷移能力增強

Figure 6.The effects of QUE on ERK, AKT and eNOS protein expression and activation in EPCs at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6 QUE處理不同時間對ERK、AKT和eNOS蛋白表達和激活的影響

8 PI3K抑制劑BYL719和ERK抑制劑FR180204抑制AKT和ERK的活化

Figure 7.The effects of QUE at different concentrations on the protein expression and activation of ERK, AKT and eNOS in the EPCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖7 QUE在不同濃度對ERK、AKT和eNOS蛋白表達和激活的影響

結果顯示，與對照組相比，100 μmol/L QUE可明顯激活AKT、eNOS和ERK蛋白(P<0.01)；給予PI3K抑制劑BYL719預處理后，能明顯抑制AKT和ERK蛋白的活化(P<0.01)；給予ERK抑制劑FR180204預處理，能明顯抑制ERK的活化(P<0.01)，但未能阻斷AKT的活化；但兩者對QUE誘導的eNOS蛋白表達升高和活化均有抑制作用，見圖8。

討 論

自Asahara等[8]首次從人外周血分離出EPCs后，大量學者致力于對來源于骨髓或外周血EPCs的研究。EPCs起源于成血管細胞，細胞表型具有較強的可塑性[9]。因此，在不同的培養條件下，誘導分化的EPCs能表達不同的表面標志，這就在一定程度上限制了EPCs從基礎研究向臨床應用轉化的順利實施。近年來，多數學者普遍認為，根據培養時間的長短，EPCs主要分為早期EPCs和晚期EPCs。早期EPCs表面表達CD133和CD34等，隨著培養時間的延長，晚期EPCs能夠表達更加成熟的內皮系標志，如FLK-1和vWF等，并顯示出較強的增殖、遷移能力[10]。來源于骨髓或外周血的EPCs在多種生理和病理過程中發揮重要作用，它們能夠通過再內皮化，促進血管內膜損傷內皮的修復；通過血管新生，增加缺血部位的血液灌流，改善組織缺血缺氧狀態[11]。研究發現，心血管疾病危險因素的累積與EPCs功能紊亂及數量降低存在密切關系[12]。因此，提高EPCs生物學功能可能有望成為治療AS的主要策略之一。

QUE是黃酮類化合物家族中的一種黃酮醇，在洋蔥、蘋果等蔬菜水果中含量豐富，具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗癌及抗過敏反應等[13]。近年來，許多研究報道QUE能在AS、缺血再灌注損傷、高血壓等心血管疾病中發揮保護作用[13]，因此吸引了越來越多的學者關注。Shen等[15]發現給予高脂飲食的ApoE-/-小鼠QUE(1.5 mg/d)2周后，與安慰劑組相比，QUE組能對抗氧化誘導的內皮損傷和AS進展。Yang等[16]發現QUE通過下調ICAM-1、VCAM-1等炎癥因子，能夠對抗H2O2誘導的血管內皮細胞損傷，從而發揮其心血管保護作用，在一定程度上阻礙AS的發展。然而，一些學者在其它動物模型和細胞類型中并未得出一致結果。Lin等[17]和Zhao等[18]研究發現，QUE能夠抑制轉基因斑馬魚胚胎節間血管、背部動脈及尾部靜脈的形成；在體外，QUE呈濃度依賴性地抑制人臍靜脈內皮細胞的成血管作用，部分通過VEGF/VEGFR2信號通路調控。此外，由于QUE水溶性差、不穩定，且首過消除效應明顯，導致其生物利用度低下[19]。因此，在QUE的臨床應用中，仍需開發新的劑型以提高QUE的溶解性和可用率。

Figure 8.The effects of BYL719 and FR180204 on the protein expression and activation of ERK, AKT and eNOS induced by QUE in EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsQUE group.

圖8 BYL719和FR180204對QUE誘導的ERK、AKT和eNOS蛋白表達和激活的影響

本研究以EPCs為研究對象，在給予QUE處理后，采用MTT法、Transwell法和Western blot法檢測QUE對EPCs活力、遷移能力及AKT、eNOS和ERK蛋白表達和激活的影響。結果顯示，QUE呈濃度依賴性提高EPCs活力和遷移能力；AKT、eNOS和ERK蛋白分析表明，QUE能激活AKT、eNOS和ERK的磷酸化。PI3K/AKT和ERK信號轉導通路在細胞多種生理過程中起著極為重要的作用，涉及調節細胞生長、發育及死亡等。為了進一步確認QUE是否通過PI3K/AKT/eNOS和ERK/eNOS信號通路調控EPCs生物學功能，給予PI3K抑制劑BYL719和ERK抑制劑FR180204預處理，結果發現，QUE可明顯上調p-AKT、eNOS、p-eNOS和p-ERK蛋白表達，BYL719能抑制QUE對AKT和ERK的磷酸化；FR180204能明顯抑制ERK的活化，而未能阻斷AKT的活化；但兩者對QUE誘導的eNOS蛋白表達和磷酸化作用均有明顯抑制作用，提示QUE通過PI3K/AKT/eNOS和ERK/eNOS通路提高EPCs的增殖和遷移功能。我們前期研究結果發現，載脂蛋白A-Ⅰ模擬肽rev-D4F能通過PI3K/AKT信號途徑提高小鼠骨髓源EPCs增殖、遷移和成血管等生物學功能[20-21]。同時，Wang等[22]發現白藜蘆醇通過ERK/eNOS信號通路可減輕流體剪切力導致的內皮細胞氧化應激損傷。

綜上所述，QUE能部分通過PI3K/AKT/eNOS和ERK/eNOS信號轉導通路，提高EPCs活力和遷移能力，發揮其心血管保護作用。然而，除了以上2條信號通路，QUE是否還能通過其它傳遞途徑調控EPCs生物學功能，如p38 MAPK、Sirt1等，仍需進一步研究。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Quercetin improves biological functions of rat bone marrow-derived EPCs

JIANG Lu-lu1, 3, YANG Na-na2, CHEN Qiao-rui2, GAO Xiang2, YAO Shu-tong2, WANG Da-xin3, QIN Shu-cun2

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,TheSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China;2InstituteofAtherosclerosis,KeyLaboratoryofAtherosclerosisinUniversitiesofShandong,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China;3DepartmentofCardiovascularMedicine,NorthernJiangsuPeople’sHospital,Yangzhou225001,China.E-mail:13583815481@163.com;daxinw2002@sina.com)

AIM: To investigate the effect of quercetin on the biological functions of rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and its potential mechanisms. METHODS: The bone marrow-derived mononuclear cells of Sprague-Dawley rats were isolated by density gradient centrifugation. The differentiated EPCs were cultured specially and stained with DiI-Ac-LDL and FITC-UEA-1. CD133+and FLK-1+were detected on the cell surfaces. After 14 d, the EPCs were incubated with a PI3K inhibitor BYL719 (3 μmol/L) and an ERK inhibitor FR180204 (15 μmol/L). After incubation of the inhibitors for 2 h, the cells were treated with quercetin at different concentrations (0, 10, 20, 40, 80 and 100 μmol/L). MTT assay and Transwell assay were used to detect cell viability and the number of migratory cells. The protein levels of AKT, eNOS, ERK and their phosphorylated status were determined by Western blot. RESULTS: Quercetin enhanced the viability and migration of the EPCs at a dose-dependent manner. However, the PI3K inhibitor BYL719 suppressed the QUE-induced cell viability and migration. Moreover, ERK inhibitor FR180204 exerted the similar inhibitory effect on the cell viability but had no effect on cell migration. Quercetin activated the phosphorylation of AKT, eNOS and ERK. On the other hand, BYL719 was observed to inhibit the phosphorylation of AKT and ERK. FR180204, however, was showed to inhibit the phosphorylation of ERK only. On the contrast, the stimulatory effects that quercetin exerted on the expression of eNOS and its phosphorylation were suppressed by BYL719 and FR180204. CONCLUSION: Quercetin stimulates the viability and migration of EPCs via PI3K/AKT/eNOS and ERK/eNOS signaling pathway, which would be beneficial for cardiovascular health.

Quercetin; Endothelial progenitor cells; Endothelical nitric oxide synthase

1000- 4718(2017)05- 0843- 08

2016- 12- 19

2017- 03- 29

國家自然科學基金資助項目(No. 81600360)；山東省自然科學基金資助項目(No. ZR2012HL18)；山東省教育廳科技計劃(No. J14LK03)；江蘇省“333工程”二層次項目(No. BRA2015171)

R329.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.013

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 秦樹存 Tel: 0538-6222986; E-mail: 13583815481@163.com; 王大新 Tel: 0514-87373039; E-mail: daxinw2002@sina.com

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