阻斷Dll4-Notch信號通路對哮喘小鼠Th17細胞分化的影響*

張維溪， 翁翠葉， 賈宵宵， 朱婷婷， 曾澤宇， 孔璐丹， 潘靈芝

[溫州醫科大學附屬第二醫院、育英兒童醫院兒童變態反應(過敏)與免疫科， 浙江 溫州 325027]

阻斷Dll4-Notch信號通路對哮喘小鼠Th17細胞分化的影響*

張維溪△， 翁翠葉， 賈宵宵， 朱婷婷， 曾澤宇， 孔璐丹， 潘靈芝

[溫州醫科大學附屬第二醫院、育英兒童醫院兒童變態反應(過敏)與免疫科， 浙江 溫州 325027]

目的： 探討哮喘小鼠體內Delta樣配體4(Delta-like ligand 4, Dll4)-Notch信號通路阻斷對輔助性T細胞17(Th17細胞)分化的影響。方法: 30只雄性BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、生理鹽水對照組、哮喘模型組、Dll4單克隆抗體干預組和IgG對照組。肺組織切片進行免疫組織化學染色，定性分析Dll4的表達。流式細胞術分析各組小鼠脾臟Th17細胞在CD4+T淋巴細胞中的比例。采用Western blot法檢測小鼠脾臟分離淋巴細胞中維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid-related orphan receptor γt，RORγt)的蛋白表達。應用酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組小鼠血清中白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)的含量。結果: 與哮喘模型組比較，Dll4單克隆抗體干預組Dll4表達存在明顯差異。與哮喘模型組比較，Dll4單克隆抗體干預組脾臟分離CD4+T淋巴細胞中Th17細胞的比例和RORγt表達水平均存在統計學顯著性(P<0.05)。Dll4單克隆抗體干預組小鼠血清IL-17的表達與哮喘模型組之間的差異也存在統計學顯著性(P<0.01)。結論: 阻斷Dll4-Notch信號通路對哮喘小鼠Th17細胞分化起到抑制作用。

哮喘； Delta樣配體4； Notch受體； 輔助性T細胞17； 白細胞介素17

支氣管哮喘(簡稱哮喘)的本質是許多炎癥細胞如淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞等參與的慢性氣道炎癥，其中T淋巴細胞起著重要的作用。輔助性T細胞17(T helper 17 cells，Th17細胞)及其產生的細胞因子白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)能夠加重哮喘的氣道炎癥[1-2]。

哺乳動物中存在4種Notch受體(Notch1～4)和5種Notch配體，5種配體分別屬于2個不同的家族，即Delta樣家族(Delta-like ligands，Dll；包括Dll1、Dll3和Dll4)和Jagged家族(Jagged1和Jagged2)[3]。胡美等[4]研究表明，Notch能調控哮喘小鼠氣道上皮下纖維化這一氣道重構現象，抑制Notch信號通路可減輕氣道上皮下纖維化。我們前期的研究表明，哮喘組Notch1和Notch2受體表達增強[5]。Huang等[6]研究表明，調節性T細胞可以通過Dll4-Notch信號通路改善氣道重塑。卵清蛋白(ovalbumin，OVA)致敏小鼠分離的樹突狀細胞的Dll4表達涉及Th17分化，1,25-二羥維生素D3可以起到抑制Dll4表達、減少Th17細胞分化的作用[7]。另有研究證實，人樹突狀細胞Notch配體Dll4可以調控Th1和Th17的分化[8]。

近年研究表明，Notch信號通路在T細胞的分化和活化中發揮著重要作用，與哮喘發病關系密切[9]。因此，有必要通過組織學檢查及干預調控研究，以進一步闡明阻斷Dll4-Notch信號通路是否能夠影響哮喘小鼠Th17細胞分化，旨在為哮喘的治療提供靶點。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

OVA購于Sigma；淋巴細胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限公司；RPMI-1640 培養基和胎牛血清購于Gibco；小鼠Dll4和IL-17 ELISA試劑盒購于eBioscience；佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin)、莫能星(monensin)、RIPA 強裂解液和BCA試劑盒購于碧云天生物技術研究所；辣根過氧化物酶標記羊抗兔和PVDF膜購于北京索萊寶科技有限公司；ECL發光液和蛋白marker購于Thermo；Fix & Perm 固定破膜劑購于Invitrogen；FITC-抗小鼠CD4和PE-抗小鼠IL-17A購于BD。

2 主要方法

2.1 動物分組、模型制備及肺組織的采集及處理 SPF 級雄性BALB/c小鼠30只，4～6周，體重(20±2) g，來自上海斯萊克實驗動物有限公司，在溫州醫科大學SPF級實驗動物中心飼養。動物實驗獲得溫州醫科大學動物保護和利用委員會的批準。采用隨機數字表法將30只小鼠分為5組：正常對照(control)組、哮喘模型組(OVA組)、生理鹽水對照組(OVA+NS組)、Dll4單克隆抗體干預組(OVA+anti-Dll4組)和IgG對照組(OVA+IgG組)。參照課題組既往采用的方法制備模型，分別在第1天和第13天通過小鼠腹腔注射0.01% OVA/Al(OH)3混合液0.1 mL(其中含有OVA10 μg 和Al(OH)3凝膠20 mg)致敏，從第25天至第32天連續8 d每天以1% OVA生理鹽水溶液進行霧化激發，每次30 min[5, 10]。生理鹽水組、Dll4單克隆抗體干預組和IgG對照組第25天起連續8 d每只小鼠在OVA 激發之前30 min分別腹腔注射200 μg生理鹽水、anti-Dll4和非特異性IgG。在末次激發后24 h內處死小鼠，取脾臟用于淋巴細胞分離培養。同時取右肺組織用4%多聚甲醛固定，送病理科石蠟包埋切片，HE染色，免疫組化。

2.2 分離小鼠脾臟淋巴細胞 取雄性BALB/c小鼠，脫臼處死，浸泡在75%乙醇中15 min；無菌操作臺中剖開小鼠腹腔取脾臟，剪去周圍的結締組織，于盛有冷PBS液的無菌培養皿中漂洗；使用10 mL注射器底部輕輕碾磨脾臟，邊碾磨邊加PBS，使其透過200目細胞篩網獲得脾臟單個核細胞懸液；用無血清RPMI-1640培養基重懸細胞，進行細胞計數。

2.3 流式細胞術檢測小鼠脾臟淋巴細胞中Th17細胞的比例 刺激培養后的各孔細胞收集到1.5 mL離心管，1 000 r/min，離心5 min，棄上清；冷buffer重懸1次，1 000 r/min 離心5 min；buffer重懸細胞，調整濃度至2×1010/L；分別轉移1×106個脾臟CD4+T細胞(50 μL)到2個1.5 mL EP管中，剩余細胞留做維甲酸相關孤兒受體γt (retinoid-related orphan receptor γt，RORγt)蛋白檢測；在抗體管中加入0.5 μL抗小鼠FITC-CD4抗體，在同型管加入0.5 μL CD4同型單抗，輕輕振蕩混勻；4 ℃避光孵育30 min；用200 μL buffer 洗滌1次，1 000 r/min，離心5 min，去上清液；每管內加入Fix & Perm試劑盒中的A劑(固定劑)100 μL進行固定，充分混勻；室溫下避光孵育15 min；用200 μL buffer 緩沖液洗滌1次，1 000 r/min 離心5 min，去上清液；每管加入Fix & Perm試劑盒中試劑B(破膜劑)100 μL；抗體管內加入1.25 μL的PE-IL-17A單抗，同型管內加入l.25 μL的IL-17A同型抗體；混勻后4 ℃避光孵育30 min；用1 mL buffer洗滌1次，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液；用200 μL 1%多聚甲醛重懸細胞； 盡快上機分析。

2.4 Western blot法檢測RORγt蛋白的表達 取分離的小鼠脾淋巴細胞，制備不同濃度梯度的蛋白標準品，測定蛋白濃度(BCA法)。通過上樣樣本配制、制膠與上樣、電泳、轉膜、麗春紅蛋白染色、封閉、結合 I 抗、結合 II 抗、化學發光、結果分析等完成系列實驗步驟。

2.5 免疫組化檢測肺組織Dll4蛋白的表達 完成免疫組化染色過程，光學顯微鏡下觀察各組肺組織切片染色情況，定性分析比較Dll4的表達。

2.6 ELISA法檢測IL-17 的含量 采用ELISA法檢測IL-17的含量，酶標儀測定吸光度(A)，根據樣品A值查出相應樣品的含量。

3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計軟件分析，計量資料實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性檢驗采用Levene 檢驗，方差齊者兩兩比較采用Bonferroni 法；方差不齊者采用Dunnett’T3法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺組織染色結果

肺組織HE染色結果顯示，正常對照組氣管、支氣管、血管旁及肺泡內炎癥細胞浸潤不明顯。與正常對照組比較，哮喘模型組、生理鹽水對照組和IgG對照組小鼠氣管、支氣管、血管旁及肺泡內嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤明顯，而Dll4單克隆抗體干預組小鼠肺組織炎癥細胞明顯減少，炎癥改變較輕,見圖1。

Figure 1.Pathological changes of the lung tissues from mice (HE staining, ×400).

圖1 小鼠肺組織病理改變

2 免疫組化顯示各組小鼠肺組織Dll4蛋白的表達情況

各組肺組織免疫組化染色后，在相同條件的光學顯微鏡下觀察各組切片染色情況。哮喘模型組、生理鹽水對照組和IgG對照組肺組織切片著色較正常對照組及Dll4單克隆抗體干預組顯著，提示正常對照組和Dll4單克隆抗體干預組肺組織Dll4蛋白表達相對較少，見圖2。

Figure 2.Dll4 protein expression was detected by immunohistochemical imaging (×400).

圖2 免疫組化法測定Dll4蛋白表達

3 流式細胞術分析各組小鼠脾臟Th17細胞在CD4+T淋巴細胞中的比例

哮喘模型組、生理鹽水對照組、Dll4單克隆抗體干預組和IgG對照組脾CD4+T淋巴細胞中Th17細胞的比例顯著高于正常對照組(P<0.05)，Dll4單克隆抗體干預組脾CD4+T淋巴細胞中Th17細胞的比例顯著低于哮喘模型組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Anti-Dll4 antibody decreased the differentiation of Th17 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOVA group;△P<0.05vsOVA+IgG group.

圖3 Anti-Dll4 抗體減少Th17細胞的分化

4 Western blot法檢測各組小鼠脾淋巴細胞中RORγt蛋白的含量

哮喘模型組、生理鹽水對照組和IgG對照組脾淋巴細胞中RORγt蛋白的含量顯著高于正常對照組(P<0.01)，Dll4單克隆抗體干預組RORγt蛋白的含量顯著低于哮喘模型組(P<0.01)，IgG對照組RORγt蛋白的含量顯著高于抗體干預組(P<0.01),見圖4。

5 ELISA檢測各組小鼠血清中IL-17的含量

哮喘模型組和IgG對照組小鼠血清IL-17的表達量顯著高于正常對照(P<0.01)，Dll4單克隆抗體干預組小鼠血清IL-17的表達顯著低于哮喘模型組(P<0.01),見圖5。

討 論

Th17細胞表達特異性轉錄因子RORγt，并且產生細胞因子IL-17，其在炎癥性疾病如哮喘的發病之中發揮了關鍵的作用[11]。有研究發現，哮喘小鼠Th17和IL-17水平顯著高于正常小鼠，而且IL-17在過敏原激發后24 h內顯著升高[12]。系列研究表明抑制Th17細胞的分化可以改善哮喘的發展[13-15]。Th17細胞分泌的特征性細胞因子IL-17加重了氣道炎癥。與正常對照組比較，哮喘患者尤其中重度哮喘患者痰液IL-17 mRNA水平增高[16]。另有研究發現，重癥哮喘患者Th17相關的細胞因子IL-17A和IL-17F增多[17]。過敏原吸入激發的過敏性哮喘Th17細胞和IL-17A水平增加，提示Th17在過敏原誘發的氣道反應之中可能起作用[12]。本研究發現哮喘小鼠脾臟CD4+T 淋巴細胞中Th17細胞的比例升高，血清IL-17水平明顯增加。

Figure 4.The protein expression of RORγt determined by Wes-tern blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsOVA group;△△P<0.01vsOVA+IgG group.

圖4 Western blot 法檢測RORγt蛋白表達情況

Figure 5.The serum level of IL-17 was evaluated by ELISA. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsOVA group.

圖5 ELISA檢測各組小鼠血清中IL-17的含量

近年研究表明,Notch信號通路在T細胞的分化和活化中發揮著重要作用，與哮喘發病關系密切[9]。Notch基因于1917年由Morgan首次在果蠅體內發現，該基因部分功能缺失會在果蠅翅膀邊緣造成缺口(notch)，故由此得名。Notch廣泛存在于從無脊椎動物到哺乳動物等多種生物體內，參與了多種組織細胞的信號識別、增殖、分化和凋亡等功能，對細胞命運的決定中起著重要作用。Notch在固有免疫之中的作用已經擴展至調控T細胞的分化及其相關功能[18]。我們先前的研究發現，通過使用Notch信號通路阻滯劑γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor，GSI)干預哮喘小鼠的研究發現，GSI可以通過下調Notch1抑制哮喘小鼠體內的Notch信號通路，從而減輕哮喘炎癥反應及癥狀[19]。Notch信號通路中的配體對一些炎癥相關性疾病也有特定的調控作用。當前的研究顯示，Dll4蛋白表達哮喘小鼠較對照組的肺組織顯著增高。人樹突狀細胞Notch配體Dll4可以調控Th1和Th17的分化[8]。Piggott等[20]發現Jagged1-Fc可競爭性抑制Notch通路，抑制了Th1和Th17的反應，表明Notch與其配體之間的相互作用參與對T細胞維持和生存的調節作用。有研究證實，Dll4直接參與抗原特異性T細胞產生Th1/Th17反應的過程，涉及實驗性自身免疫性腦脊髓炎和多發性硬化的發病機制[21]。Mukherjee等[22]的研究表明Dll4可以上調T細胞活化，促進IL-17的產生。有研究顯示，多巴胺D1樣受體信號可增強B細胞激活轉錄因子的作用,從而增加Th17轉錄因子RORγt的表達，因此，多巴胺D1樣受體信號可以通過調節Th17細胞的分化,促進過敏性哮喘的發生[23]。我們的研究發現，哮喘模型組與Dll4單克隆抗體干預組比較，DLL4表達明顯增高；與哮喘模型組比較，Dll4單克隆抗體干預組脾臟分離淋巴細胞中Th17細胞在CD4+T淋巴細胞中的比例降低，RORγt表達水平降低，血清IL-17的水平下降。

因此，我們的研究表明通過使用Dll4 抗體阻斷Notch信號通路，可以起到抑制哮喘小鼠Th17細胞分化的作用。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of Dll4-Notch signaling pathway blockade on development of Th17 cells in asthmatic mice

ZHANG Wei-xi, WENG Cui-ye, JIA Xiao-xiao, ZHU Ting-ting, ZENG Ze-yu, KONG Lu-dan, PAN Ling-zhi

(DepartmentofPediatricAllergyandImmunology,TheSecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren’sHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:zhangweixi112@163.com)

AIM: To explore the effect of Delta-like ligand 4 (Dll4)-Notch signaling pathway blockade on the development of Thelper 17(Th17) cells in the asthmatic mice. METHODS: Male BALB/c mice were randomly divided into 5 groups: control group, asthma group, normal saline group, anti-Dll4 antibody group, and immunoglobulin G group. The protein expression of Dll4 was detected by immunohistochemical staining. The proportion of Th17 cells in mouse spleen isolated CD4+T cells was measured by flow cytometry. The protein expression of Th17 transcription factor retinoid-related orphan receptor γt (RORγt) was determined by Western blot. The serum level of interleukin (IL)-17 was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: The expression of Dll4 in the lung tissues from asthma group significantly increased as compared with anti-Dll4 antibody group. The proportion of Th17 cells in CD4+T cells was significantly down-regulated, and the protein expression of RORγt in the lung tissues was significantly reduced in anti-Dll4 antibody group compared with asthma group (P<0.05). Moreover, the serum level of IL-17 in anti-Dll4 antibody group was significantly reduced compared with asthma group (P<0.01).CONCLUSION: The blockade of Dll4-Notch signaling pathway inhibits the differentiation of Th17 cells in asthmatic mice.

Asthma; Delta-like ligand 4; Notch receptor; T helper 17 cells; Interleukin-17

1000- 4718(2017)05- 0865- 06

2016- 10- 10

2017- 03- 09

國家自然科學基金資助項目(No. 81100015)；浙江省自然科學基金資助項目(No. Y2090327)；浙江省醫藥衛生科技計劃骨干人才項目(No. 2014RCA020)；浙江省衛生高層次創新人才資助項目

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.016

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