軟脂酸對INS-1胰島細胞TXNIP表達的影響*

張 倩， 梁男男， 吳向征， 王 瑾， 趙嘉惠， 焦向英△

(山西醫科大學 1生理學教研室， 2轉化醫學研究中心， 山西 太原 030001)

軟脂酸對INS-1胰島細胞TXNIP表達的影響*

張 倩1， 梁男男1， 吳向征1， 王 瑾1， 趙嘉惠2， 焦向英1△

(山西醫科大學1生理學教研室，2轉化醫學研究中心， 山西 太原 030001)

目的： 2型糖尿病患者體內持續高水平的游離脂肪酸會損傷胰島β細胞。硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)是內源性的硫氧還蛋白(Trx)抑制蛋白。已知高糖刺激可引起TXNIP表達上調，促進胰島β細胞凋亡，而游離脂肪酸對TXNIP的影響尚不明確。本實驗旨在研究軟脂酸對TXNIP表達的影響及機制。方法: 在使用不同濃度和不同作用時間的軟脂酸充分預實驗的基礎上，確定使用添加0.5 mmol/L軟脂酸的RPMI-1640培養基培養INS-1胰島細胞24 h，測定細胞TXNIP的表達變化、細胞凋亡情況及可能的調控因子變化。結果: 與對照組相比，軟脂酸組TXNIP的mRNA水平和蛋白表達量均明顯增高(P<0.01)，軟脂酸組凋亡明顯高于對照組(P<0.01)。軟脂酸組的核因子κB (NF-κB)蛋白磷酸化水平升高(P<0.01)，使用不同的NF-κB抑制劑PDTC和SN50均可阻斷軟脂酸誘導的TXNIP表達上調。結論: 飽和脂肪酸軟脂酸可通過增加NF-κB磷酸化而上調TXNIP的表達，從而誘導INS-1胰島細胞凋亡。

軟脂酸； INS-1細胞； 硫氧還蛋白相互作用蛋白； 核因子κB

糖尿病作為威脅人類健康的重要疾病，其主要發病機制在于胰島β細胞凋亡和功能異常[1-2]。在誘導β細胞凋亡的眾多因素中，除高血糖引起的糖毒性以外，游離脂肪酸的脂毒性也扮演了重要的角色。研究表明，2型糖尿病患者體內長期高水平的游離脂肪酸，特別是飽和脂肪酸可以引起胰島素抵抗、胰島β細胞功能紊亂及β細胞凋亡的增加，進而加重糖尿病[3-5]。

硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)又名VDUP1或TBP2，是目前發現的唯一內源性的硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)結合抑制蛋白[6]，在糖尿病各組織中其表達均顯著升高，已有大量研究證明高糖可引起TXNIP表達明顯升高，并介導β細胞凋亡[7-8]。而糖尿病時同時出現的游離脂肪酸升高對TXNIP表達的影響尚不明確。因此本課題旨在研究飽和脂肪酸軟脂酸(palmitate，PA)對INS-1胰島細胞TXNIP表達的影響以及其可能機制。

材 料 和 方 法

1 主要材料

INS-1細胞(中國醫學科學院基礎醫學研究所-協和細胞庫)；RPMI-1640培養基(HyClone)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自北京全式金生物技術有限公司；0.25%含EDTA胰酶、100×青霉素-鏈霉素溶液和無脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自北京索萊寶科技有限公司；軟脂酸和NF-κB抑制劑PDTC(Sigma)；NF-κB抑制劑SN50(Santa Cruz)；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；反轉錄和RT-PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；凝膠試劑盒和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；抗TXNIP和p-NF-κB抗體(Abcam)；抗caspase-3、cleaved caspase-3和 β-actin抗體(CST)；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)。

2 軟脂酸的配制

將256.42 mg 軟脂酸溶于5 mL的無水乙醇中，60 ℃水浴以致完全溶解，再加入50 mmol/L NaOH 配制成50 mmol/L的儲存液(-20 ℃保存)。臨用時，使用含0.55% 無脂肪酸BSA的RPMI-1640培養基將軟脂酸儲存液稀釋為0.5 mmol/L作為工作濃度。

3 實驗方法

3.1 INS-1細胞培養 用含15%胎牛血清、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養基于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養INS-1細胞，定期更換培養基，待細胞長至80%時進行傳代和實驗處理。

3.2 實驗分組 將處于對數生長期的INS-1細胞分為對照組(含0.55% 無脂肪酸BSA的RPMI-1640培養基)和軟脂酸組(0.5 mmol/L軟脂酸及含0.55% 無脂肪酸BSA的RPMI-1640培養基)，均培養24 h后收集細胞進行指標測定。

3.3 CCK-8實驗測定軟脂酸的量效曲線和時間曲線 將細胞接種至96孔板，待細胞貼壁處于對數生長期時，分別使用0、0.05、0.10、0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L濃度的軟脂酸孵育INS-1細胞24 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，孵箱孵育2 h后在450 nm測定吸光度值。使用0.5 mmol/L的軟脂酸分別孵育INS-1細胞2 h、12 h、24 h和48 h，后續采用CCK-8法測定吸光度值 。

3.4 Real-time PCR測定INS-1細胞TXNIP的mRNA表達 INS-1細胞總RNA提取使用離心柱型總RNA提取試劑盒，cDNA合成用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix。擴增使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix，按照試劑盒說明書進行操作，結果用2-ΔΔCt法計算。所使用的TXNIP 上游引物序列為5’-AGTGATTGGCAGCAGGTC-3’，下游引物序列為5’-GGTGTCTGGGATGTTTAGG-3’；GAPDH上游引物序列為5’-ATGGTGAAGGTCGGTGTG-3’，下游引物序列為5’-AACTTGCCGTGGGTAGAG-3’。

3.5 Western blot法測定TXNIP、cleaved caspase-3、caspase-3和p-NF-κB的蛋白水平 將INS-1細胞與0.5 mmol/L軟脂酸孵育24 h后收集，加入裂解液50 μL(PMSF 2 μL和廣譜磷酸酶抑制劑 2 μL)，超聲細胞粉碎機破碎細胞，于4 ℃裂解3 h，13 000×g、4 ℃離心15 min，收集上清。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取定量蛋白進行SDS-PAGE電泳分離。電泳完成后將蛋白轉移到PVDF膜上，將膜置于5% BSA封閉液中室溫封閉2 h。I 抗4 ℃孵育過夜。次日收集 I 抗，TBST洗膜5 min、3次。加入對應的辣根過氧化物酶標記的II 抗，4 ℃孵育2 h。洗膜3次，加入超敏ECL發光液，使用Kodak Image Station 400系統曝光獲取蛋白條帶。以β-actin為內參照，分析各組蛋白表達量。

3.6 流式細胞術測INS-1細胞凋亡 將INS-1細胞接種到6孔板，待細胞貼壁長至80%時，加入2 mL軟脂酸(0.5 mmol/L)孵育24 h，使用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細胞2次(1 000 r/min離心5 min)收集細胞加入200 μL binging buffer 懸浮細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)，混勻，室溫避光反應15 min，使用流式細胞儀進行觀察檢測。

4 統計學處理

本實驗采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析，實驗結果以均數±標準誤(mean±SEM)表示。統計方法采用t檢驗和雙因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 軟脂酸具有細胞毒性，并呈濃度和時間依賴性

使用0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75和1 mmol/L濃度逐漸增加的脂肪酸孵育INS-1細胞24 h，CCK-8實驗結果顯示隨著軟脂酸濃度的增加細胞存活率逐漸降低，具有濃度依賴性。同時，以不同軟脂酸處理時間0、2、12、24和48 h觀察，表明軟脂酸的損傷作用也具有時間依賴性，見圖1。

Figure 1.The effects of palmitate on the viability of the INS-1 cells. A: INS-1 cells were treated with increasing concentration of palmitate for 24 h; B: INS-1 cells were incubated with 0.5 mmol/L palmitate for different time. Mean±SEM.n=6.

圖1 軟脂酸對INS-1細胞活性的影響

2 軟脂酸引起TXNIP表達上調

使用0.5 mmol/L軟脂酸孵育INS-1細胞24 h，與對照組相比，軟脂酸組TXNIP 的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.Palmitate (PA; 0.5 mmol/L for 24 h) up-regulated TXNIP expression at protein (A) and mRNA (B) levels in the INS-1 cells. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖2 軟脂酸上調INS-1細胞的TXNIP mRNA和蛋白水平

3 軟脂酸可增加INS-1細胞凋亡

如圖3 所示，0.5 mmol/L軟脂酸處理INS-1細胞24 h，可導致cleaved caspase-3/caspase-3水平上調(P<0.05)。使用Annexin/FITC染色流式細胞術分析結果顯示，軟脂酸組細胞凋亡指數明顯高于對照組(P<0.01)。

4 軟脂酸通過增加NF-κB的磷酸化水平而誘導TXNIP表達

與對照組相比，軟脂酸組的p-NF-κB蛋白水平顯著升高(P<0.01)。加入NF-κB抑制劑PDTC(20 μmol/L)后，與不加抑制劑的對照相比，軟脂酸處理引起的TXNIP mRNA和蛋白水平上調均明顯被抑制(P<0.01)。使用SN50(50 mg/L；一種多肽類的NF-κB抑制劑)干預，同樣顯著抑制了軟脂酸引起的TXNIP表達(P<0.01)，見圖4。

討 論

根據國際糖尿病聯盟公布的最新數據，2013年，全球糖尿病患病率為8.3%，中國糖尿病患病人數已高達9 840萬，居全球首位。預計到2035年，中國糖尿病患病人數將增長到1.43億[9]。這些數據提示我們，糖尿病已經成為了我國現在及將來必須面對和解決的重要社會問題。因此，進一步研究糖尿病的發病和損傷機制并探尋新的治療靶點就顯得極為迫切和重要。

糖尿病的主要發病機制是胰島β細胞數目的減少和功能異常，引起胰島β細胞減少的主要原因為細胞的凋亡[10]，而關于糖尿病時引起胰島β細胞凋亡的原因，則眾說紛紜。TXNIP是糖尿病時各組織和細胞顯著高表達的一種蛋白，在糖尿病動物模型和臨床糖尿病患者體內均發現TXNIP水平顯著升高[11]。我們課題組的前期研究表明，使用腺病毒過表達TXNIP可通過激活內質網應激、caspase-8和caspase-9等途徑引起INS-1胰島細胞凋亡[12]。已有證據表明高葡萄糖是誘導TXNIP表達增加的重要原因[13]，而糖尿病患者體內除了糖代謝紊亂導致的高血糖外，常伴隨著游離脂肪酸的明顯升高，升高的游離脂肪酸對TXNIP表達的影響目前尚不明確。2016年Mandala等[14]的研究表明飽和脂肪酸軟脂酸可誘導骨骼肌細胞的TXNIP表達。在本研究中，發現軟脂酸能夠上調INS-1細胞TXNIP表達，同時可誘導INS-1胰島細胞凋亡增加，說明TXNIP參與介導了軟脂酸誘導的胰島細胞凋亡。

Figure 3.Palmitate induced INS-1 cell apoptosis. A: INS-1 cells were treated with 0.5 mmol/L palmitate for 24 h, and cleaved caspase-3 protein levels were assessed by Western blot; B: using flow cytometry, the apoptosis of INS-1 cells was analyzed. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3 軟脂酸誘導INS-1細胞凋亡

Figure 4.Palmitate up-regulated TXNIP expression by NF-κB phosphorylation. A: p-NF-κB-p65 was measured by Western blot in the INS-1 cells treated with palmitate at 0.5 mmol/L; B～C: INS-1 cells were treated palmitate at 0.5 mmol/L with or without NF-κB inhibitor PDTC (20 μmol/L), TXNIP expression was assessed by Western blot and real-time PCR; D: TXNIP protein levels were measured in the INS-1 cells treated with palmitate with or without NF-κB inhibitor SN50 at 50 mg/L. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsPA.

圖4 軟脂酸通過磷酸化NF-κB上調TXNIP

游離脂肪酸增多，可產生大量的中間代謝產物神經酰胺，其積累可以促進胰島β細胞凋亡[15]。神經酰胺通過激活NF-κB調節TXNIP表達[16]。同時有研究表明，在TXNIP的啟動子部位包含NF-κB的結合位點[17]，因此NF-κB可能參與軟脂酸引起的TXNIP表達上調。本研究發現軟脂酸能夠激活NF-κB，使其磷酸化水平增加，NF-κB磷酸化后，將獲得轉位到細胞核內的能力，進而調節下游靶基因的表達[18]，可能就包括TXNIP。為了進一步證實NF-κB是否參與了軟脂酸誘導的TXNIP表達，本研究也使用NF-κB 2種不同機制的抑制劑PDTC和SN50，二者均阻斷了軟脂酸誘導的TXNIP表達上調，表明NF-κB的確參與了軟脂酸引起的TXNIP上調。

綜上所述，本研究證實了軟脂酸可以誘導TXNIP表達增加，進而促進了INS-1胰島細胞的凋亡；軟脂酸上調TXNIP表達的機制與NF-κB的激活相關。提示TXNIP作為糖尿病時代謝紊亂引起的高糖、高脂肪酸的共同下游蛋白，在胰島β細胞凋亡的發生中可能發揮重要作用，從而加重加快糖尿病的進展，因此TXNIP可作為糖尿病針對性治療的重要靶標。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of palmitate on TXNIP expression in INS-1 islet cells

ZHANG Qian1, LIANG Nan-nan1, WU Xiang-zheng1, WANG Jin1, ZHAO Jia-hui2, JIAO Xiang-ying1

(1DepartmentofPhysiology，2CentreforTranslationalMedicine,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:jiaoxyty@163.com)

AIM: Chronic exposure to elevated levels of free fatty acids (FFAs) in type 2 diabetes patients is toxic to pancreatic β-cells. Thioredoxin (Trx)-interacting protein (TXNIP), an endogenous Trx-inhibiting protein, is up-regulated by glucose and is a critical mediator of hyperglycemia-induced β-cell apoptosis in diabetes. However, the effects of FFAs on TXNIP are unknown. In this experiment we observed the effect of palmitate on TXNIP expression in cultured INS-1 islet cells and the pathways involved were analyzed meanwhile. METHODS: After the full basis of preliminary experiment of incubating INS-1 cells with palmitate at different concentrations for different time, INS-1 islet cells were cultured with 0.5 mmol/L palmitate for 24 h. TXNIP expression, cell apoptosis, and expression of transcription factors related to TXNIP transcriptional regulation were determined. RESULTS: Compared with control group, the expression of TXNIP at mRNA and protein levels in palmitate group was significantly up-regulated (P<0.01). Cleaved caspase-3/caspase-3 ratio was increased in palmitate group (P<0.05), and the apoptosis of the INS-1 cells was also significantly increased (P<0.01). Palmitate enhanced the phosphorylation of nuclear factor-κB (NF-κB) (P<0.01), and the NF-κB inhibitors， PDTC and SN50， both blocked the palmitate-induced up-regulation of TXNIP expression. CONCLUSION: Saturated fatty acid palmitate enhances the expression of TXNIP. The mechanism of palmitate-induced TXNIP expression may be associa-ted with the increase in NF-κB phosphorylation.

Palmitate; INS-1 cells; Thioredoxin-interacting protein; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2017)05- 0908- 05

2016- 11- 25

2016- 12- 12

國家自然科學基金資助項目(No. 30800399); 山西省重點實驗室建設項目(No. 2014011049-12); 山西醫科大學科技創新基金資助項目(No. 01201406)

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.023

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