Bcl-2和PCNA表達在大鼠成肌細胞氧化應激損傷中的作用*

毛挺挺， 鄭亞華， 方紅波， 謝魯吉， 張偉丹， 姜麗萍

(1寧波市醫療中心李惠利東部醫院， 浙江 寧波 325000； 2上海交通大學醫學院附屬新華醫院， 上海 200092)

Bcl-2和PCNA表達在大鼠成肌細胞氧化應激損傷中的作用*

毛挺挺1， 鄭亞華1， 方紅波1， 謝魯吉1， 張偉丹1， 姜麗萍2△

(1寧波市醫療中心李惠利東部醫院， 浙江 寧波 325000；2上海交通大學醫學院附屬新華醫院， 上海 200092)

目的： 探討Bcl-2、PCNA等蛋白表達在成肌細胞氧化應激損傷中的意義。方法: 將對數生長期成肌細胞進行分組，結合堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)預處理2 h及過氧化氫處理，分為正常對照(control)組、單純bFGF組、氧化應激組(H2O2組)和干預組(bFGF+H2O2組)。免疫組化檢測Bcl-2和Bax陽性沉積顆粒；免疫熒光觀察成肌細胞形態及Bcl-2和Bax熒光表達；Western blot檢測Bcl-2、PCNA等蛋白表達情況。結果: 免疫熒光及免疫組化結果顯示，與氧化應激組比較，干預組Bcl-2表達增加，Bax表達減少；Western blot顯示，干預組Bcl-2和PCNA水平增加，Bax水平降低。結論: 氧化應激誘導的大鼠成肌細胞損傷參與肌細胞病理進程。Bcl-2和PCNA表達上調可減輕成肌細胞損傷程度。

深部組織損傷； 氧化應激； L6成肌細胞； 堿性成纖維細胞生長因子

以往壓瘡研究集中于局部皮損及破潰范圍，往往忽視皮膚完整性深部組織損傷(deep tissue injury，DTI)的發生。近年來研究顯示，壓瘡受累組織尤以肌層最易損傷[1]。缺血再灌注為DTI形成重要機制，大量氧自由基及肌細胞損傷等病理反應集中于缺血再灌注過程之中，并在DTI惡化進程中起到重要作用[2-3]。目前已有報道顯示，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)能夠有效緩解大鼠深部肌組織損傷[4]，然而尚未有研究闡明bFGF與壓瘡肌細胞氧化應激間的關系。因此，本研究通過體外模擬壓瘡氧化應激過程，檢測Bcl-2、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)等蛋白表達，探討bFGF具體作用，以期在細胞水平為壓瘡肌組織損傷防治提供一定思路。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠成肌細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，采用含1%青/鏈霉素及10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，置細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)進行常規培養，2～3 d傳代1次，待其生長至對數期時，以0.25%胰蛋白酶消化后進行分組實驗。

重組人堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF)由溫州生物與天然藥物研究所提供；過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)購自Sigma；胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素和DMEM高糖基礎培養基均為Gibco產品；Hoechst 33258購自碧云天生物科技有限公司；兔單克隆抗Bcl-2、Bax抗體，鼠單克隆抗PCNA、GAPDH抗體及實驗中所用的 II 抗羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、羊抗兔IgG-HRP、驢抗兔IgG-FITC均由Santa Cruz提供。

2 主要方法

2.1 實驗分組及干預 常規進行細胞培養，待細胞生長為指數增長期后，統一換液。根據有無H2O2及bFGF干預可分為4組：正常對照(control)組、單純bFGF組、氧化應激組(H2O2組；H2O2濃度及作用時間的確定參照文獻研究方法及我們前期體外DTI細胞氧化應激模型構建過程[5-6])和干預組(bFGF+H2O2組；bFGF濃度綜合參考文獻[7-8]選擇)。正常對照組不做任何處理；單純bFGF組提前給予100 μg/L bFGF 2 h；氧化應激組采用100 μmol/L H2O2培養基處理4 h；干預組給予100 μg/L bFGF預給2 h后，加入100 μmol/L H2O2繼續孵育4 h。

2.2 SABC免疫組化 采用SABC法，4%多聚甲醛固定，3% H2O2-甲醇溶液抑制內源性過氧化物酶，5% BSA封閉30 min，Bax和Bcl-2的 I 抗濃度均為 1∶200，常規設立陰性對照(用PBS代替 I 抗)，于4 ℃冰箱過夜。滴加1∶1 000稀釋的 II 抗，置于37 ℃恒溫箱孵育2 h。PBS洗去未結合抗體，DAB顯色，中性樹膠封片，陽性結果為棕黃色顆粒沉積。

2.3 Bcl-2和Bax免疫熒光染色 4%多聚甲醛4 ℃固定，Triton X-100靜置15 min后，5% BSA室溫封閉15 min，滴加1∶200稀釋的Bax I 抗，4 ℃過夜。PBS 洗去未結合抗體(5 min×3次)，避光滴加1∶300稀釋的熒光 II 抗，黑色濕盒內37 ℃孵育1 h。Hoechst 復染1 min，PBS清洗 5 min×3次，滴加抗熒光淬滅劑并封片，熒光顯微鏡下拍片。染色結果Hoechst為藍色，以此定位肌細胞核；FITC熒光 II抗呈綠色，標記Bcl-2和Bax蛋白，隨機選取3個高倍視野(×400)，采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件，統計任意單位內平均熒光強度。

2.4 Western blot 收集不同批次成肌細胞，加裂解液后刮取蛋白液，離心取上清，采用考馬斯亮藍測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE 分離蛋白后電轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST洗去脫脂奶粉(7 min×3次)，兔單克隆Bcl-2、Bax抗體及鼠單克隆PCNA抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜7 min×3次，HRP標記IgG II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，最后加入BeyoECL Plus顯色液于凝膠成像儀器曝光。GAPDH作為內參照，實驗重復3 次。運用Quantity One凝膠圖像分析系統對結果進行灰度分析，以相對值定量表達各蛋白。

3 統計學處理

應用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 免疫組織化學檢測各組成肌細胞Bcl-2和Bax蛋白表達

免疫組織化學檢測結果顯示：Bcl-2和Bax免疫陽性產物為棕黃色顆粒，主要位于胞漿。正常對照組及單純bFGF組成肌細胞胞質內含有大量Bcl-2陽性顆粒，少數細胞為Bax陽性表達；氧化應激組Bcl-2陽性顆粒銳減，Bax陽性細胞數量增加；bFGF干預后，Bcl-2陽性細胞增多，Bax表達隨之減少，見圖1、表1。

2 成肌細胞Bcl-2和Bax免疫熒光表達情況

正常成肌細胞形態為梭形或成纖維樣，細胞生長速度較快，Bax熒光強度低，Bcl-2熒光強。應激組肌細胞Bax熒光表達呈強陽性，細胞體積變小，胞質收縮明顯，細胞突起變短或消失。bFGF干預后，成肌細胞Bax陽性蛋白表達顯著減少，Bcl-2蛋白表達增加，見圖2、表2。

Figure 1.Bcl-2 and Bax expression in rat myoblasts detected by immunohistochemistry (×200).

圖1 各組成肌細胞Bcl-2和Bax蛋白免疫組化結果

表1 各組成肌細胞Bcl-2和Bax免疫組化結果

Table 1.The relative expression of Bcl-2 and Bax in rat myoblasts detected by immunohistochemistry (Mean±SD.n=3)

GroupBcl-2BaxControl1.00±0.041.00±0.13bFGF1.05±0.161.16±0.14H2O2 0.35±0.12** 2.27±0.23**bFGF+H2O20.86±0.05##1.14±0.10##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsH2O2.

3 Bcl-2、Bax和PCNA等蛋白的表達水平

正常對照組及單純bFGF組Bax蛋白呈現低水平表達，Bcl-2和PCNA蛋白水平較高。氧化應激組成肌細胞Bax蛋白表達顯著增加，同時PCNA和Bcl-2蛋白水平降低。給予bFGF干預后，Bcl-2和PCNA表達增加，Bax蛋白水平下調，見圖3、表3。

討 論

壓瘡深部組織損傷為壓瘡中組織嚴重損傷類型，其發生隱匿、后期極易進展為難愈性創面。近年來研究顯示，缺血再灌注生成氧自由基致使肌組織繼發性損傷為DTI關鍵所在[9]。過氧化氫是機體細胞氧化應激主要成分之一，目前已應用于體外DTI相關研究[10-11]。本實驗基于前期結果[5]，以100 μmol/L叔丁基過氧化氫作用4 h為氧化應激組，在此基礎上探討bFGF對大鼠成肌細胞Bcl-2、PCNA等蛋白影響。

Figure 2.Bcl-2 and Bax expression in rat myoblasts detected by immunofluorescence (×400).

圖2 各組成肌細胞Bcl-2和Bax蛋白免疫熒光檢測結果

表2 各組成肌細胞Bcl-2和Bax熒光表達情況

Table 2.The relative expression of Bcl-2 and Bax in rat myoblasts detected by immunofluorescence (Mean±SD.n=3)

GroupBcl-2BaxControl1.00±0.141.00±0.07bFGF0.97±0.031.07±0.06H2O20.40±0.04**1.51±0.16**bFGF+H2O20.70±0.13##0.82±0.02##

**P<0.01vscontrol;##P< 0.01vsH2O2.

Figure 3.The protein levels of Bcl-2, Bax and PCNA in the rat myoblasts detected by Western blot.

圖3 成肌細胞Bcl-2、Bax和PCNA蛋白表達

研究表明，Bcl-2家族蛋白在壓瘡早期肌肉組織受損中具有重要作用，隨著Bcl-2/Bax比值的降低，組織損傷逐漸加重[12]。本實驗氧化應激組Bax水平上升而Bcl-2蛋白呈下降趨勢，這與張恩等[13]在III期壓瘡潰瘍創面中發現Bax蛋白增加，Bcl-2減少結果一致。在對氧化應激組成肌細胞應用bFGF進行干預后，Bcl-2表達增加明顯，Bax水平下降，提示bFGF上調Bcl-2/Bax比值有助于降低成肌細胞損傷，然而損傷減輕也有可能與bFGF上調細胞損傷耐受閾或是成肌細胞本身增殖活性增高相關。

PCNA是一種分子量為36 kD的細胞核蛋白，在細胞周期中同DNA合成一致，為細胞從G0、G1期進入S期的前提[14]。PCNA在各種損傷中常存在表達下降現象，而損傷恢復期伴隨該指標的增加。bFGF是一種廣譜促有絲分裂的生長因子[15]。在小型豬全層皮膚缺損創面的研究中，陳濤等[16]發現bFGF可通過上調PCNA表達刺激 DNA合成，促進上皮細胞增殖與遷移，加速創面修復。傳統觀念中骨骼肌為已分化組織，不具備再生能力，近年來在肌組織基底膜內發現存在著具有增殖活性的成肌細胞，在燒傷應激等損傷恢復過程中通過PCNA結合細胞微觀檢測發現成肌細胞能夠增殖融入肌纖維內，以維持肌組織體積與功能的穩定[17]。本實驗氧化應激組成肌細胞PCNA含量處于較低水平，這可能與氧自由基攻擊位于核小體中組蛋白成分，造成DNA損傷后引起成肌細胞損傷增加有關，同時氧化應激本身可破壞成肌細胞的微環境。王雅一等[18]報道PCNA可與蛋白因子結合參與細胞周期調控、DNA修復以及細胞損傷等過程。通過外源性bFGF的干預，本實驗發現bFGF可上調成肌細胞PCNA和Bcl-2表達，這可能與外源性bFGF結合成肌細胞膜表面受體，通過轉入具有增殖活性的細胞核內，發揮生物學功能有關。

表3 各組成肌細胞Bcl-2、Bax和PCNA蛋白表達水平

*P<0.01vscontrol;#P<0.01vsH2O2.

綜上所述，本實驗發現bFGF能夠減少氧化應激過程中成肌細胞Bax蛋白水平，同時增加Bcl-2、PCNA表達，為bFGF在壓瘡深部組織損傷的治療提供了一定的實驗基礎與新思路。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of Bcl-2 and PCNA expression in rat myoblast injury induced by hydrogen peroxide

MAO Ting-ting1, ZHENG Ya-hua1, FANG Hong-bo2, XIE Lu-ji1, ZHANG Wei-dan1, JIANG Li-ping2

(1NingboMedicalCenterLihuiliEasternHospital,Ningbo325000,China;2XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:lipingj@shsmu.edu.cn)

AIM: To explore the role of Bcl-2 and PCNA expression in the injury of rat myoblasts induced by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: Rat myoblasts at growth phase were divided into 4 groups based on basic fibroblast growth factor (bFGF) and H2O2levels: normal control group, bFGF group, model group (H2O2group) and treatment group (bFGF+H2O2group). The expression of Bcl-2 and Bax was observed by immunohistochemistry and fluorescence methods. The protein levels of Bax, Bcl-2 and PCNA were determined by Western blot. RESULTS: Compared with model group, both immunofuorescence and fluorescence in treatment group showed enhanced Bcl-2 and low expression of Bax. Furthermore, the results of Western blot showed up-regulated PCNA and Bcl-2 protein and decreased Bax expression in treatment group.CONCLUSION: Oxidative stress results in the pathologic changes of myoblasts, and the up-regulation of Bcl-2 and PCNA may attenuate myoblast injury.

Deep tissue injury; Oxidative stress; L6 myoblasts; Basic fibroblast growth factor

1000- 4718(2017)05- 0935- 05

2016- 08- 11

2017- 02- 08

國家自然科學基金資助項目(No. 81372064); 上海市教委護理高原學科建設資助項目

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.028

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△通訊作者 Tel: 13868311990； E-mail: lipingj@shsmu.edu.cn