白藜蘆醇對花萼海綿誘癌素所致小鼠空間記憶障礙的預防作用*

李 穎， 向 瑤， 鄧惠萍， 朱婷婷， 趙玉蓉， 李夏春

(三峽大學醫學院生理學與病理生理學系， 湖北 宜昌 443002)

白藜蘆醇對花萼海綿誘癌素所致小鼠空間記憶障礙的預防作用*

李 穎， 向 瑤， 鄧惠萍， 朱婷婷， 趙玉蓉， 李夏春△

(三峽大學醫學院生理學與病理生理學系， 湖北 宜昌 443002)

目的： 探討腹腔注射白藜蘆醇對昆明小鼠側腦室注射花萼海綿誘癌素引起的空間記憶障是否有預防作用。方法: 2月齡昆明小鼠44只隨機分為4組，分別為生理鹽水對照組、模型組、白藜蘆醇低劑量組和白藜蘆醇高劑量組；生理鹽水對照組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，白藜蘆醇低劑量組和白藜蘆醇高劑量組分別腹腔注射白藜蘆醇5 mg/kg和10 mg/kg共21 d，除對照組外，第22天從側腦室注射花萼海綿誘癌素4 μL, 第27天進行Morris水迷宮定位航行訓練，持續6 d，24 h后進行尋找平臺潛伏期檢測。再處死小鼠，進行灌流固定做高爾基染色觀察神經元樹突和樹突棘，并取新鮮腦海馬勻漿后檢測SOD活性。結果: 白藜蘆醇低劑量組顯著縮短側腦室注射花萼海綿誘癌素引起的逃避潛伏期。白藜蘆醇低劑量組顯著增加側腦室注射花萼海綿誘癌素引起的CA1區錐體神經元樹突的長度和分枝數目。白藜蘆醇低劑量組顯著增加側腦室注射花萼海綿誘癌素引起的海馬CA1區錐體神經元樹突棘的密度。白藜蘆醇高劑量組顯著增加花萼海綿誘癌素引起的海馬SOD活性，而低劑量組并不改變SOD活性。結論: 低劑量白藜蘆醇對側腦室注射花萼海綿誘癌素引起的空間記憶障礙具有預防作用，其機制可能與減輕花萼海綿誘癌素引起的樹突損傷有關。

白藜蘆醇； 花萼海綿誘癌素； 空間記憶； 樹突

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是具有抗腫瘤、保護心血管、防止機體老化等功效的多酚類物質，其主要作用機制為抗氧化應激和抗炎癥反應。研究報道白藜蘆醇可改善健康老人的記憶力和海馬功能及糖代謝[1]。最近研究發現慢性白藜蘆醇處理可改善衰老大鼠的單胺神經遞質合成和認知[2]。另外，也發現白藜蘆醇可顯著減輕鏈脲佐菌素引起的大鼠記憶障礙并對tau過度磷酸化有抑制作用[3-4]。蛋白磷酸酶(protein phosphatase,PP)2A活性下降在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患者腦內tau蛋白過度磷酸化、Aβ過度產生和突觸抑制中起關鍵作用[5]。最近發現在11月齡AD小鼠(Tg2576)海馬和前額葉皮層沉默抑制PP2A的基因I2PP2A的表達，可減少I2PP2A和PP2A催化亞基的結合，從而使PP2A活性恢復，也可通過抑制APP的過度磷酸化和β-分泌酶的活性減輕淀粉樣變，還可改善小鼠的學習和記憶能力[6]。因此，糾正PP2A活性下降和水平下降在AD的治療中起著重要作用。花萼海綿誘癌素(calyculin A，CA)是PP2A和PP1的特異性抑制劑，研究報道花萼海綿誘癌素側腦室注射可引起大鼠突觸素丟失、記憶維持障礙及tau蛋白過度磷酸化[6-7]等AD樣病理變化。但大鼠的基因與人類基因差異比小鼠與人類的基因差異大很多；為獲得更加接近人類AD病的研究結果，我們從小鼠側腦室注射花萼海綿誘癌素，觀察其是否引起小鼠空間記憶障礙，同時檢測白藜蘆醇是否對其有改善作用，探討在C57小鼠腹腔注射白藜蘆醇3周是否能預防側腦室注射花萼海綿誘癌素引起的空間記憶障礙。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

昆明小鼠20～25 g，雄性，44只(實驗動物合格證號為42010200000249，常規分籠喂養于光照/黑暗為12 h/12 h 的恒溫環境，自由攝食和飲水。飼養至2月齡后開始實驗，實驗遵循三峽大學實驗動物使用相關倫理要求。

2 主要試劑藥物和儀器

花萼海綿誘癌素購于Abcam；白藜蘆醇購于MedChemExpress。Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統為成都泰盟產品。

3 主要方法

3.1 動物分組和腹腔注射 小鼠按照隨機分組原則分為生理鹽水對照(control)組、CA模型組、低劑量白藜蘆醇組(low Res組)和高劑量白藜蘆醇組(high Res組)。生理鹽水組和CA組的小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。研究發現腹腔注射白藜蘆醇(4 mg/kg和8 mg/kg)可升高小鼠雌激素和腦啡肽酶的水平，并減輕LPS誘導的工作記憶和局部運動障礙[8]，我們選擇了與其近似的濃度，low Res組和high Res組的小鼠分別腹腔注射5 mg/kg和10 mg/kg白藜蘆醇，連續注射21 d。

3.2 側腦室注射花萼海綿誘癌素 第22天，小鼠經腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后固定于小鼠腦立體定位儀上。顱頂備皮消毒后，切開頭頂皮膚，暴露前囟。微量注射器針尖定位為：前后位為距前囟-0.4 mm；左右位為中線旁開1.0 mm；背腹位為距顱骨表面2.3 mm。以顱骨鉆鉆孔，將10 μL微量注射器針頭經針孔準確插入側腦室停留5 min，緩慢注入終濃度為16 μmol/L的花萼海綿誘癌素(花萼海綿誘癌素儲備液濃度為320 μmol/L，用DMSO溶解，注射前用生理鹽水稀釋至16 μmol/L)4 μL(約1 μL/min)，注射完畢后停留5 min，緩慢退出微量注射器，迅速用骨蠟封閉針孔，嚴格消毒后縫合手術切口[7]。小鼠置于加溫平板上待其完全蘇醒后，放回籠中飼養。生理鹽水對照組按同樣步驟同側海馬注入同體積生理鹽水，放回籠中飼養。4 d后，待頭部傷口愈合后進行水迷宮訓練。

3.3 水迷宮實驗 實驗過程中保持環境安靜，空間參照物品位置不變，以排除外界干擾。各組進行水迷宮測試。整個實驗共計7 d，每只小鼠每天在4個象限各訓練1次，連續6 d，每次游泳時限為90 s。潛伏期指大鼠從放入水池到找到隱藏平臺所用的時間。若超過90 s未找到平臺者停止記錄，將潛伏期記錄為90 s，由測試者引導其上平臺休息30 s后進行下一次訓練。若找到平臺也在平臺上鞏固記憶5 s。第7天測試，記錄其潛伏期作為衡量大鼠學習和測試成績的指標。

3.4 Golgi染色 各組取3只小鼠進行灌注固定后取腦，用新鮮媒染液避光浸泡3 d，每日更換媒染液。1.5%硝酸銀水溶液充分置換媒染液，搖晃清洗3次，直至置換的液體顏色清亮，之后置暗處鍍銀3 d，每日更換新的硝酸銀水溶液。腦塊采用30%蔗糖脫水，冰凍切片機切片，厚度為35 μm，切片立即用95%乙醇和無水乙醇脫水10 min，二甲苯透明5 min后，采用中性塑膠封片。每只小鼠留含海馬的24張切片以備照相統計分析。

3.5 SOD活性的測定 各組取5只小鼠的兩側海馬，用生理鹽水勻漿后，按照SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書步驟測定SOD抑制率。再用BSA法測定各組腦勻漿蛋白濃度，計算SOD活力。

4 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示；采用Image-Pro Plus軟件統計樹突長度、樹突分枝數目和每10 μm的樹突棘密度，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同劑量Res對花萼海綿誘癌素所致小鼠尋找平臺逃避潛伏期延長的影響

各組小鼠連續7 d進行定位航行訓練后，分析尋找隱蔽平臺的逃避潛伏期結果顯示：生理鹽水對照組的逃避潛伏期隨著訓練次數增加逐漸縮短，第6～7天其逃避潛伏期穩定在最短時間。花萼海綿誘癌素組的逃避潛伏期第2天輕度下降后，第3天又返回第1天水平，第4～7天基本穩定在平均40 s水平，顯著高于對照組。低劑量白藜蘆醇組與CA組相比，各天的逃避潛伏期均顯著縮短。高劑量白藜蘆醇組與CA組相比，其各天逃避潛伏期進一步延長，見圖1。結果說明低劑量白藜蘆醇可顯著改善CA引起的空間學習和記憶障礙，高劑量白藜蘆醇不僅對CA引起的空間學習和記憶障礙沒有改善作用，反而加重其毒性作用。

2 不同劑量白藜蘆醇對花萼海綿誘癌素所致小鼠CA1區錐體神經元樹突長度和分枝數目的影響

高爾基染色結果顯示：生理鹽水對照組CA1區神經元樹突分枝較多而長，CA組CA1區神經元樹突數目與生理鹽水對照組相比少而短，低劑量白藜蘆醇組與CA組相比，其樹突長度延長且數目顯著增多，高劑量白藜蘆醇組與CA組相比樹突分枝數目和樹突長度無顯著改變，見圖2。結果表明：CA側腦室注射后引起CA1區神經元樹突發育受損，低劑量白藜蘆醇可顯著減輕 CA引起的樹突生長受損，高劑量白藜蘆醇對CA引起的樹突生長受損沒有保護作用。

Figure 1.Intraperitoneal injection of low-dose resveratrol (Res) attenuated space learning and memory impairment induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCA group.

圖1 低劑量白藜蘆醇腹腔注射減輕CA側腦室注射引起的空間學習和記憶障礙

Figure 2.Intraperitoneal injection of low-dose resveratrol (Res) attenuated dendritic length shortening and the decrease in the total number of dendritic branches induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). Mean±SD.n=20～30.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCA group.

圖2 低劑量白藜蘆醇腹腔注射減輕CA側腦室注射引起的CA1區錐體神經元樹突長度變短和樹突分枝數目減少

3 不同劑量白藜蘆醇對花萼海綿誘癌素所致小鼠CA1區錐體神經元樹突棘密度的影響

樹突棘的形態和定量分析結果顯示，生理鹽水對照組CA1區神經元樹突棘密度較高，CA組CA1區神經元樹突棘密度低；低劑量白藜蘆醇組與CA組相比，樹突棘密度顯著升高。高劑量白藜蘆醇組與CA組樹突棘密度無顯著改變，見圖3。結果說明低劑量白藜蘆醇顯著改善CA誘導的樹突棘密度降低。

Figure 3.Intraperitoneal injection of low-dose resveratrol (Res) attenuated the decreased density of dendritic spines in the hippocampal CA1 neurons induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). The scale bar=10 μm. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCA group.

圖3 腹腔注射低劑量白藜蘆醇改善CA側腦室注射引起的海馬CA1區神經元樹突棘密度降低

4 不同劑量白藜蘆醇對花萼海綿誘癌素所致SOD活性的影響

SOD活性檢測結果顯示，生理鹽水組與CA組相比SOD活性顯著降低；低劑量白藜蘆醇組與CA組相比SOD活性無顯著改變；高劑量白藜蘆醇組與CA組相比SOD活性顯著升高，見圖4。結果說明低劑量白藜蘆醇顯著改善CA引起的空間學習記憶力降低與SOD活性改善可能無關。

Figure 4.Intraperitoneal injection of high-dose resveratrol (Res) attenuated the decreased SOD activity in the hippocampus induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCA group.

圖4 腹腔注射高劑量白藜蘆醇改善CA側腦室注射引起的海馬SOD活性降低

討 論

隨著人類平均壽命的顯著延長，與增齡密切相關的AD的發病率顯著上升。AD的發病機制尚不完全清楚，其治療也無顯著改善。喜歡喝紅酒的法國人AD患病率顯著低于西方其它高蛋白飲食為主的發達國家[9]，引起西方對于釀制紅酒中的紅葡萄中的主要成分是否具有延緩神經退變的作用進行研究。白藜蘆醇是紅葡萄皮中含有的高濃度的多酚。它很容易跨過血腦屏障，其活性在腦內可持續4 h。最近的研究提示攝入白藜蘆醇可改善健康老人的記憶力，提示白藜蘆醇對增齡引起的記憶減退有改善作用[1]。AD患者腦內過度磷酸化的tau蛋白組成的神經原纖維纏結數目與患者的癡呆程度呈正相關。而PP2A水平和活性下降是引起AD患者tau蛋白過度磷酸化的重要機制[5]。因此， PP2A活性下降是引起AD患者認知障礙的重要原因。但PP2A活性下降引起認知障礙的機制尚不完全清楚。

以前的研究結果顯示PP2A活性下降可引起大鼠突觸素丟失和tau蛋白過度磷酸化；小鼠的行為反應盡管沒有大鼠豐富多變，但小鼠與人的同源性更近，其結果可能與人更相近。因此，本研究采用KM小鼠腹腔注射白藜蘆醇21 d后側腦室注射花萼海綿誘癌素降低PP2A活性，觀察腹腔注射白藜蘆醇升高外周血白藜蘆醇對PP2A活性降低引起的認知障礙是否有預防作用。結果發現，低濃度白藜蘆醇腹腔注射能顯著預防PP2A活性降低引起的空間學習記憶能力降低，顯著增加CA1區神經元樹突長度和密度以及樹突棘密度，但并不增加海馬SOD活性。該結果提示：低劑量白藜蘆醇預防PP2A活性下降引起的空間記憶障礙可能與其增加CA1區神經元樹突生長和樹突棘形成有關。最近的研究顯示白藜蘆醇處理可降低小鼠PGC-1α的乙酰化水平，降低海馬腦片miR-124和miR-134的表達水平，同時顯著增加海馬腦片cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)和腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達水平，而miR-134被認為位于大鼠神經元突觸的樹突區可負性調節興奮性突觸后樹突棘形狀。因此，白藜蘆醇改善CA引起的CA1區神經元樹突形狀可能與其降低miR-124和miR-134的表達水平有關[10-11]。我們曾報道上調星形膠質細胞PP2A水平也可改善APP/PS1雙突變小鼠的空間記憶障礙和老年斑沉積[12]，也有報道白藜蘆醇在PC細胞和神經元可通過阻斷鎘誘導的PP2A-A亞基表達下降和逆轉PP2A去甲基化和磷酸化，顯著減輕鎘誘導的PP2A活性抑制[13]，因此，白藜蘆醇減輕CA誘導的學習記憶障礙可能與其升高PP2A-A亞基的表達和阻斷PP2A的去甲基化或磷酸化有關。其具體機制值得進一步探討。另外，本研究發現高劑量白藜蘆醇對CA引起的空間記憶障礙沒有保護作用可能與其對CA引起的樹突發育中的損傷沒有預防作用有關。最近也有報道白藜蘆醇可通過激活AMP活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]降低海馬BDNF和CREB磷酸化的水平，影響海馬和齒狀回神經祖細胞的生存和增殖，使小鼠空間學習記憶能力下降，提示高濃度白藜蘆醇可能不利于神經祖細胞生存和增殖，進而影響到樹突發育[14]。

綜上所述，本研究發現低劑量白藜蘆醇腹腔注射可顯著改善CA側腦室注射引起的空間學習和記憶障礙，并顯著改善CA引起的樹突損傷。本研究為以學習記憶障礙為主要癥狀的老年性癡呆疾病的預防和治療提供了基礎。

[1] Witte AV, Kerti L, Margulies DS, et al. Effects of resveratrol on memory performance, hippocampal functional connectivity, and glucose metabolism in healthy older adults[J]. J Neurosci, 2014, 34(23):7862-7870.

[2] Sarubbo F, Ramis MR, Aparicio S, et al. Improving effect of chronic resveratrol treatment on central monoamine synthesis and cognition in aged rats[J]. Age (Dordr), 2015, 37(3):9777.

[3] Sharma M, Gupta YK. Chronic treatment with trans-resveratrol prevents intracerebroventricular streptozotocin induced cognitive impairment and oxidative stress in rats[J]. Life Sci, 2002, 71(21):2489-2498.

[4] Sharma M, Briyal S, Gupta YK. Effect of alpha lipoic acid, melatonin and transresveratrol on intracerebroventri-cular streptozotocin induced spatial memory deficit in rats[J]. Indian J Physiol Pharmacol, 2005, 49(4):395-402.

[5] Liu F, Grundke-Iqbal I, Iqbal K, et al. Contributions of protein phosphatases PP1, PP2A, PP2B and PP5 to the regulation of tau phosphorylation[J]. Eur J Neurosci, 2005, 22(8):1942-1950.

[6] Liu GP, Wei W, Zhou X, et al.Silencing PP2A inhibitor by lenti-shRNA interference ameliorates neuropathologies and memory deficits in tg2576 mice[J]. Mol Ther, 2013, 21(12):2247-2257.

[7] Sun L, Liu SY, Zhou XW, et al. Inhibition of protein phosphatase 2A- and protein phosphatase 1-induced tau hyperphosphorylation and impairment of spatial memory retention in rats[J]. Neuroscience, 2003, 118(4):1175-1182.

[8] El-Sayed NS, Bayan Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease[J]. Adv Exp Med Biol, 2015, 822:107-118.

[9] Orgogozo JM, Dartigues JF, Lafont S, et al. Wine consumption and dementia in the elderly: a prospective community study in the Bordeaux area[J]. Rev Neurol (Pa-ris)， 1997， 153(3):185-192.

[10]Zhao YN, Li WF, Li F, et al.Resveratrol improves lear-ning and memory in normally aged mice through microRNA-CREB pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 435(4):597-602.

[11]Schratt CM, Tuebing F, Nigh EA, et al. A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development[J].Nature, 2006, 439(7074):283-289.

[12]李夏春, 彭敏峰, 高麗華, 等.上調星形膠質細胞中PP2A對APP/PS1雙轉基因小鼠的神經保護作用[J].中國病理生理雜志, 2016, 32(7):1189-1194.

[13]Liu CX, Zhang RJ, Sun CX. Resveratrol prevents cadmium activation of ERK1/2 and JNK pathways from neuronal cell death via protein phosphatases 2A and 5[J].J Neurochem, 2015, 135(3):466-478.

[14]Park HR, Kong KH, Yu BP, et al. Resveratrol inhibits the proliferation of neural progenitor cells and hippocampal neurogenesis[J]. J Biol Chem, 2012, 287(51):42588-425600.

(責任編輯：陳妙玲, 羅 森)

Prevention of resveratrol on spatial memory loss of mice induced by calyculin A

LI Ying, XIANG Yao, DENG Hui-ping, ZHU Ting-ting, ZHAO Yu-rong, LI Xia-chun

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,MedicalSchool,ThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China.E-mail: 624275550@qq.com)

AIM: To explore the preventive effect of resveratrol on spatial memory loss of the mice induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). METHODS: Kunming mice of 2 months (n=44) were divided into saline control group, CA group, low-dose resveratrol group and high-dose resveratrol group. The mice in control group and CA group were intraperitoneally injected with equal volume of saline for 21 d, while the mice in low-dose resveratrol group and high-dose resveratrol group were intraperitoneally injected with resveratrol at 5 mg/kg and 10 mg/kg, respectively. At 22 d, CA (4 μL) was injected into the lateral ventricles in CA group, low-dose resveratrol group and high-dose resveratrol group. Morris water maze test was applied to examine the changes of learning and memory abilities of the mice at 27 d. The Golgi staining was used to observe the morphological changes of dendrites and dendritic spines. The hippocampal tissues were homogenated to detect SOD activity. RESULTS: Low-dose resveratrol significantly decreased the escape latency delay induced by CA. Low-dose resveratrol attenuated the decreases in the number of dendrites and the density of dendritic spines of neurons in hippocampal CA1 region induced by CA. High-dose resveratrol but not low-dose resveratrol attenuated the decreased SOD activity induced by CA. CONCLUSION: Resveratrol at low dose attenuates memory loss in the mice induced by CA though preventing dendrite injury.

Resveratrol; Calyculin A; Spatial memory; Dendrites

1000- 4718(2017)05- 0951- 05

2016- 05- 12

2017- 03- 17

三峽大學博士啟動基金(No. KJ2013B056)

R965； R749.2+9； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.031

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0717-6397466; E-mail: 624275550@qq.com