HIV/AIDS肺脾氣虛證與氣陰兩虛證患者尿液的代謝組學(xué)研究

馬素娜，王 娟，張海燕，張 淼

450046河南省鄭州市，河南中醫(yī)藥大學(xué)

·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

HIV/AIDS肺脾氣虛證與氣陰兩虛證患者尿液的代謝組學(xué)研究

馬素娜，王 娟，張海燕，張 淼*

450046河南省鄭州市，河南中醫(yī)藥大學(xué)

目的 探討代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證型診斷中的價值。方法 2011年12月選取河南省某地區(qū)人類免疫缺陷病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)患者23例，其中脾肺氣虛證患者12例作為HIV/AIDS肺脾氣虛證組，氣陰兩虛證患者11例作為HIV/AIDS氣陰兩虛證組。運用液相色譜質(zhì)譜分析(LC-MS)檢測23例HIV/AIDS患者的尿液代謝成分，結(jié)合主成分分析(PCA)和t檢驗分析技術(shù)，分析HIV/AIDS患者尿液的差異代謝物。結(jié)果 通過t檢驗結(jié)合1.5倍原則對數(shù)據(jù)進行的初步篩選，發(fā)現(xiàn)質(zhì)核比(m/z)為317、213的可能存在的代謝物為兩組的差異代謝物，其峰強度在HIV/AIDS氣陰兩虛證組患者中均低于HIV/AIDS肺脾氣虛證組患者(P<0.05)。PCA顯示m/z為967、155、317、213的離子物與其他離子物相距較遠(yuǎn)，可以認(rèn)為是HIV/AIDS肺脾氣虛證組和HIV/AIDS氣陰兩虛證組間潛在的差異代謝物。結(jié)論 運用代謝組學(xué)技術(shù)中的LC-MS可以將HIV/AIDS肺脾氣虛證和HIV/AIDS氣陰兩虛證尿液在代謝物輪廓上進行區(qū)分，實現(xiàn)不同中醫(yī)證型間的差異代謝物比較，代謝組學(xué)技術(shù)在指導(dǎo)中醫(yī)證型的診斷方面有良好的應(yīng)用價值。

獲得性免疫缺陷綜合征；代謝組學(xué)；證候

代謝組學(xué)是20世紀(jì)末發(fā)展起來的，繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后的一門新興學(xué)科，20世紀(jì)90年代逐漸應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域中，通過對機體中某個特定時間點代謝產(chǎn)物的定量和定性分析，從整體上評價機體當(dāng)時所處的生理或病理狀態(tài)，通過檢測和量化一個生物體整體代謝隨時間變化的規(guī)律，為研究和闡明疾病的發(fā)病機制提供客觀依據(jù)[1-2]。由于其具有與中醫(yī)學(xué)整體觀、即時性相一致的特點，在疾病機制探討及診斷尤其是中醫(yī)證候辨證中有著巨大的潛力，將成為研究者研究中醫(yī)“證”生物學(xué)基礎(chǔ)的有力工具[3-4]。本研究通過運用液相色譜質(zhì)譜分析(LC-MS)技術(shù)結(jié)合t檢驗和主成分分析(PCA)對人類免疫缺陷病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)肺脾氣虛證和氣陰兩虛證患者進行代謝組學(xué)檢測，通過對比分析初步發(fā)現(xiàn)了在代謝組學(xué)層面HIV/AIDS脾肺氣虛證和氣陰兩虛證兩者間存在的差異。

1 資料與方法

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：采用2005年國家原衛(wèi)生部推薦的《艾滋病診療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：采用“HIV/AIDS常見中醫(yī)證候診斷量表”中肺脾氣虛證診斷量表、氣陰兩虛證診斷量表為辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。HIV/AIDS肺脾氣虛證主要癥狀為：動則氣喘(記5分)、易感冒(記4分)、自汗(記3分)、泄瀉(記3分)、惡風(fēng)寒(記2分)、胸悶(記2分)、咳痰清稀(記2分)、神疲乏力(記2分)、便溏(記2分)、心悸(記1分)、舌體胖大(記1分)、舌質(zhì)淡(記1分)、舌苔白(記1分)、脈虛或弱(記1分)；HIV/AIDS氣陰兩虛證主要癥狀為：盜汗(記5分)、神疲乏力(記4分)、消瘦(記3分)、氣短(記2分)、口干咽燥(記2分)、口唇干裂(記2分)、干咳少痰(記1分)、手足心熱(記1分)、舌形瘦薄(記3分)、舌裂紋(記3分)、舌紅或淡紅(記1分)、舌苔少津(記1分)、脈虛數(shù)或細(xì)數(shù)(記2分)。各個癥狀分輕(×1)、中(×2)、重(×3)不同的權(quán)重進行量化積分。證候積分≥21分符合中醫(yī)診斷入組標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HIV試驗陽性者；(2)符合HIV/AIDS西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]和“HIV/AIDS常見中醫(yī)證候診斷量表”中肺脾氣虛證和氣陰兩虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]的患者；(3)年齡18～60歲；(4)中醫(yī)辨證經(jīng)兩名副高級以上職稱中醫(yī)專家診斷一致者；(5)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)意識不清、癡呆、精神疾病患者；(2)非感染HIV引發(fā)的嚴(yán)重臟器疾病，原發(fā)性免疫缺陷，激素化療等引起的繼發(fā)性免疫缺陷，血液病，其他原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1.4 材料和方法[6]

1.4.1 材料 試劑：甲酸、乙腈、甲醇(上海展云化工有限公司)，高純氦氣、高純氮氣(純度均>99.99%，鄭州念龍化工產(chǎn)品有限公司)；主要儀器及設(shè)備：LCQ Advantage MAX電噴霧離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀(美國賽默飛世爾科技公司)；Agilent Zorbax C18(150.0 mm×2.1 mm,3.1 μm)色譜柱(安捷倫科技有限公司)；Jouan MR23i高速冷凍離心機(離心半徑20 cm)(法國Jouan公司)；MDF5411低溫冰箱(日本三洋株式會社)；MiII-QSyntheSiS超純水器(美國MiIIPore公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)。

1.4.2 尿樣采集和處理 EP管收集患者晨尿2 ml，靜置30 min后移取1 ml，高速離心10 min，4 000 r/min，移取300 μl上清液，置于1.5 ml離心管中，加入甲醇600 μl(在混勻振蕩器中混勻約10 min)，高速冷凍離心10 min，14 000 r/min，4 ℃控溫，取800 μl上清液，濾膜過濾(濾膜孔徑0.45 μm)，即得供試品溶液。將供試品溶液放入液質(zhì)聯(lián)用儀中根據(jù)預(yù)試驗篩選出來的最佳液相色譜、質(zhì)譜條件(見表1)和洗脫梯度(見表2)對樣品進行代謝物(譜)的檢測。

表1 液相色譜、質(zhì)譜條件

表2 洗脫梯度表

2 結(jié)果

2.1 兩組同時存在的差異代謝物峰強度比較 通過t檢驗結(jié)合1.5倍原則對數(shù)據(jù)進行的初步篩選，發(fā)現(xiàn)質(zhì)核比(m/z)為317、213的可能存在的代謝物為兩組的差異代謝物，其峰強度在HIV/AIDS氣陰兩虛證組患者中均低于HIV/AIDS肺脾氣虛證組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表3HIV/AIDS肺脾氣虛組與HIV/AIDS氣陰兩虛組中同時存在的差異代謝物t檢驗結(jié)果

Table 3 T-test results of coexist differential metabolites between the two groups

組別例數(shù)317峰強度均數(shù)213峰強度均數(shù)HIV/AIDS肺脾氣虛證組12369645207286HIV/AIDS氣陰兩虛證組1121641826187組間比值171792P值001004

注：HIV=人類免疫缺陷病毒，AIDS=艾滋病

2.2 PCA 圖1(本文圖1～2彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章)中每個點代表一個樣本，其中黑色方點代表HIV/AIDS肺脾氣虛證患者，紅色菱形點代表HIV/AIDS氣陰兩虛證患者，每一個樣本的位置由其自身所包含的代謝物成分所決定，圖中顯示兩組樣本分別集中分布在不同的區(qū)域，其中HIV/AIDS肺脾氣虛證組主要分布在斜線的右上方，HIV/AIDS氣陰兩虛證組主要分布在斜線的左下方，兩組之間能夠進行明顯的區(qū)分，其組間存在顯著差異。圖2是與圖1相對應(yīng)的載荷圖，其中每個點代表一種物質(zhì)，通過每個點與原點的距離來判斷其在組間存在的差異顯著性，距離越遠(yuǎn)說明該物質(zhì)在兩組間峰強度表達差異越大，距離越近則峰強度表達差異越小，從圖中可以看出在m/z為967、155、317、213的離子物與其他離子物相距較遠(yuǎn)，可以認(rèn)為是HIV/AIDS肺脾氣虛證和HIV/AIDS氣陰兩虛證組間潛在的差異代謝物。

3 討論

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后迅速發(fā)展起來的與系統(tǒng)生物學(xué)相關(guān)的一項動態(tài)多參數(shù)應(yīng)答的新技術(shù)方法，是組學(xué)技術(shù)研究方法的重要研究領(lǐng)域[7]。其跳過生命體內(nèi)的調(diào)控過程，以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，考察生物體在某一特定生理時期內(nèi)或受刺激后所有相對低分子量代謝物的變化，通過分析內(nèi)源性代謝物的變化及其與整體生物學(xué)狀況的關(guān)系，進行定性和定量分析反映生物體受外界刺激或基因修飾等引起的變化，是系統(tǒng)生物學(xué)的一個重要分支[8-10]。代謝組學(xué)從代謝物層面來探究生命活動，較其他組學(xué)具有獨特優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于疾病機制研究、疾病診治、療效評價、藥物開發(fā)、健康評估及探索疾病潛在生物標(biāo)志物中[11-14]。其所研究分析的樣本為生物流體，代表了機體整個內(nèi)源性代謝池，從取樣到試驗再到無偏測量分析整個過程盡可能保留樣品中代謝物的整體信息，作為機體代謝終產(chǎn)物其分析結(jié)果更能說明機體表型[15-16]。代謝組學(xué)對生命的微觀過程進行整體研究，鮮明的“整體性”“辨證觀”“即時性”與中醫(yī)理論的特點不謀而合，運用代謝組學(xué)技術(shù)為克服中醫(yī)傳統(tǒng)“四診”方法的局限、從生物代謝角度研究中醫(yī)證候的內(nèi)涵提供了可靠的依據(jù)，將成為揭示中醫(yī)學(xué)科學(xué)本質(zhì)的有力工具[17]。

注：1= 人類免疫缺陷病毒(HIV)/艾滋病(AIDS)肺脾氣虛組(■黑色方點所示)，2= HIV/AIDS氣陰兩虛組(◆紅色菱形點所示)

圖1 HIV/AIDS肺脾氣虛證組與HIV/AIDS氣陰兩虛證組PLS-DA圖(樣品分布散點圖)

Figure 1 PLS-DA figure between two groups(scatter diagram of sample distribution)

圖2 HIV/AIDS肺脾氣虛證組與HIV/AIDS氣陰兩虛證組PLOT圖(載荷圖或峰/化合物/變量分布圖)

Figure 2 PLOT figure between two groups(load diagram or distribution diagram of peak/compound/variables)

中醫(yī)的“證”是機體在疾病發(fā)生、發(fā)展及演變過程中某一階段機體整體狀態(tài)的高度概括，包括病因、病性、病位及邪正盛衰的關(guān)系，反映疾病發(fā)展到某一特定階段的病理變化的本質(zhì)，具有系統(tǒng)性、整體性、時間性、模糊性的特點[18-20]。肺脾氣虛證和氣陰兩虛證是中醫(yī)診療疾病的兩種基本證型，統(tǒng)屬于中醫(yī)學(xué)“虛證”范疇，在機體中有各自獨特的癥候群，而表現(xiàn)出來的癥狀有相同的也各有其特異性的癥狀，而且在各種疾病、各個病程階段均可存在[21]。由于知識水平的層次高低不同、臨床經(jīng)驗的積累多寡不一，每位中醫(yī)臨床醫(yī)生對同一患者的認(rèn)識存在一定的差異，對疾病中醫(yī)證型的判斷也不盡相同。尤其對于剛進入醫(yī)療領(lǐng)域的臨床醫(yī)生及醫(yī)學(xué)科研工作人員，由于臨床經(jīng)驗較少，對于臨床癥狀表現(xiàn)不典型的患者，在中醫(yī)證型的診斷上可能會存在一定的不足。本研究結(jié)果顯示，m/z為967、155、317、213的代謝物認(rèn)為是HIV/AIDS肺脾氣虛證、氣陰兩虛證潛在的差異代謝物，說明運用代謝組學(xué)地檢測方法可以幫助醫(yī)生找出某種疾病各個證型存在的差異代謝物，通過對不同中醫(yī)證型代謝產(chǎn)物的檢測，幫助醫(yī)生進行臨床中醫(yī)證型判斷，從而更科學(xué)地指導(dǎo)臨床用藥。本研究將代謝組學(xué)的研究方法運用到HIV/AIDS中醫(yī)證候研究中，但由于本次只是初步探索HIV/AIDS肺脾氣虛證與HIV/AIDS氣陰兩虛證間代謝組學(xué)差異，樣本量較少，儀器設(shè)備靈敏度相對較低且人體代謝庫尚不完善，很多物質(zhì)目前還不能進行比對和確定，所檢測出來的差異代謝物不能進行定性分析，有待進一步擴大樣本量并選用靈敏度更高的儀器設(shè)備進行深入的研究。

作者貢獻：馬素娜、王娟、張淼主要進行研究設(shè)計與實施、撰寫論文并對文章負(fù)責(zé)；馬素娜、王娟、張海燕進行試驗實施、評估、資料收集；張海燕、張淼進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔莎)

Metabonomics Study on the Urine of Patients with HIV/AIDS Syndrome of Qi Deficiency of Lung and Spleen and Deficiency of Both Qi and Yin

MASu-na,WANGJuan,ZHANGHai-yan,ZHANGMiao*

HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China

*Correspondingauthor:ZHANGMiao,Researchassistant;E-mail:1043833307@qq.com

Objective To investigate the value of metabonomics technology in the diagnosis of TCM syndrome types.Methods A total of 23 patients with human immunodeficiency virus(HIV)/acquired immune deficiency syndrome(AIDS) in an area of Henan Province in December 2011 were selected.Among them,12 with syndrome of Qi deficiency of lung and spleen were taken as HIV/AIDS group of syndrome of Qi deficiency of lung and spleen,and 11 with syndrome of deficiency of both Qi and Yin were taken as HIV/AIDS group of syndrome of deficiency of both Qi and Yin.The metabolic components of urine of 23 patients with HIV/AIDS were detected by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS),and the differential metabolites of urine of patients with HIV/AIDS were analyzed by combining with analysis techniques of principal component analysis(PCA) andttest.Results Through thettest and principle of 1.5 times,the preliminary screening of data found that the possible metabolites with karyoplasmic ratio(m/z) of 317 and 213 were differential metabolites of two groups,the expression changes of the peak intensity in HIV/AIDS group of syndrome of deficiency of both Qi and Yin were lower than those in HIV/AIDS group of syndrome of Qi deficiency of lung and spleen(P<0.05).PCA showed that ions with m/z of 967,155,317 and 213 ions were far away from other ions,which could be considered as the potential differential metabolites between the two groups.Conclusion The LC-MS in metabonomics technologies can differentiate the urine of patients between the two groups from the profile of metabolites,and achieve the comparison of differential metabolites in different TCM syndromes.The metabonomics technologies has a good application value in guiding diagnosis of syndrome of TCM.

Acquired immunodeficiency syndrome;Metabolomics;Symptom complex

“十一五”國家科技重大專項(2009ZX10005021-002)——HIV/AIDS中醫(yī)基本證候系統(tǒng)生物學(xué)研究；“十二五”國家科技重大專項(2012ZX10005001-005)——HIV/AIDS中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究；河南中醫(yī)學(xué)院博士基金(BSJJ2012-12)——HIV/AIDS肺脾氣虛證患者蛋白質(zhì)組學(xué)研究；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(102300410122)——HIV/AIDS脾氣虛弱證和濕熱內(nèi)蘊證代謝組學(xué)研究

R 512.91

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.15.017

2016-10-15；

2017-03-06)

*通信作者：張淼,助理研究員；E-mail:1043833307@qq.com

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