高效液相色譜法測定不同廠家克拉霉素顆粒的溶出度

隋思博，宮麗婷

（吉林省藥品檢驗所，吉林 長春 130033）

高效液相色譜法測定不同廠家克拉霉素顆粒的溶出度

隋思博，宮麗婷

（吉林省藥品檢驗所，吉林 長春 130033）

目的采用HPLC法測定不同廠家克拉霉素顆粒的溶出度。方法采用Hibar Purospher STAR C18（250×4．6 mm，5 μm）色譜柱，柱溫：45℃，以磷酸鹽緩沖液-乙腈（600：400）為流動相，檢測波長為210 nm；流速為1．0 ml/min。結果克拉霉素在687．5～5500 μg進樣范圍內有良好的相應關系，回歸方程為y=60．663x+1540．5，r=0．9992。結論HPLC法具有準確度高、重復性好、快速、精密的優點，更加適合克拉霉素顆粒溶出度的測定。

高效液相法；克拉霉素顆粒；溶出度

克拉霉素屬于大環內酯類抗生素，主要通過與敏感細菌核蛋白體的50S亞基結合，抑制敏感細菌蛋白合成，發揮抑菌或殺菌作用。適用于治療幽門螺桿菌感染、呼吸系統感染、非淋菌性泌尿生殖道感染以及皮膚軟組織感染等。

2015年版中國藥典二部收錄了克拉霉素顆粒，溶出度采用的方法是將克拉霉素與75%硫酸反應測定其吸光度，通過試驗我們知道，硫酸反應操作復雜且效果不好。本文通過建立高效液相色譜法使試驗操作簡單，使方法更加準確、高效。

1 儀器與試藥

島津LC-2010 CHT全自動高效液相色譜儀；RC-806溶出試驗儀；克拉霉素（中國藥品生物制品鑒定所，130558-200902，97.9%）；醋酸鈉、三乙胺、磷酸二氫鉀、冰醋酸、磷酸、乙腈、超純水、0.45納米微孔濾膜；克拉霉素顆粒（海南惠普120402，130802；天津紅日1212261，1302011,1309241；湖北東信130101；湖北華世通潛龍130813）。

2 方法與結果

2.1 溶出度測定法

以0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH7.0）（取無水醋酸鈉82 g，加水7500 mL，用冰醋酸調節pH值至7.0，加水使成10000 mL）900 mL為溶出介質，轉速50轉/min，30 min時取樣，用溶出介質稀釋制成每1mL中含55 μg的溶液。

2.2 色譜條件與系統適應性條件

流動相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀9.11 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，加三乙胺2 mL，用磷酸調節pH至5.5）-乙腈(600:400)，檢測波長為210 nm；流速為1.0 ml/ min，柱溫：45oC，Hibar Purospher STAR C18 (250×4.6 mm，5μ m)色譜柱；進樣量為50 μL。克拉霉素峰的理論板數計算應高于3000，拖尾因子應小于2，克拉霉素峰與相鄰前雜質峰的分離度應大于1.5，限度為80%。

2.3 配置對照品

精密稱取克拉霉素對照品適量（約相當于主成分22 mg），置100 mL量瓶中，先加少量乙腈振搖使溶解，再加溶出介質稀釋至刻度，精密量吸取12.5 mL置50 mL量瓶中，加溶出介質，制成對照品溶液（55 μg/mL）。

2.4 檢測限與定量限檢驗

檢測限：精密量取對照品溶液1 mL，置200 mL量瓶中，用溶出介質稀釋至刻度，搖勻，作為檢測限溶液，精密量取20 μL注入液相色譜，此時信噪比為3:1，克拉霉素四種介質溶液（水、ph1.2緩沖液、ph5.0緩沖液、ph6.8緩沖液）進樣量均為5.5 ng。

定量限：精密量取檢測限溶液1 mL，置200 mL量瓶中，用溶出介質稀釋至刻度，搖勻，作為定量限溶液，精密量取20 μL注入液相色譜，此時信噪比為10：1，硝酸異山梨酯四種介質溶液進樣量均為13.75ng。

2.5 耐用性

柱溫45℃。①采用Hibar Purospher STAR C18（250×4.6 mm，5 μm）色譜柱測定。②采用Kromasil Eternity （250×4.6 mm，5 μm） PN:EH50704色譜柱測定。③采用Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5 μm）PN:990967-902色譜柱測定。采用上述三根不同廠家色譜柱柱進行試驗，結果均能很好的分離，可以用于克拉霉素顆粒的測定。

2.6 線性關系與回歸方程

精密量取對照品溶液2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL、15 mL、20 mL，分別置不同的20 mL量瓶中，用溶出介質稀釋至刻度，制成濃度分別為6.875 μg/mL、13.75 μg/mL、20.625 μg/mL、27.5 μg/mL、41.25 μg/mL、55 μg/mL的對照品溶液，各精密吸取100 μL注入液相色譜儀，橫坐標為對照品進樣量（μg），縱坐標為峰面積，計算回歸方程并且繪制標準曲線，可以得出，克拉霉素在687.5～5500 μg進樣范圍內有良好的相應關系，回歸方程為y=60.663x+1540.5，r=0.9992。見表1。

2.7 精密度實驗

取對照品溶液，重復6次進樣，50 μl/次，結果符合要求。見表2。

2.8 回收率實驗

精密稱取克拉霉素對照品22.12 mg，置100 mL量瓶中，加醋酸鹽緩沖液（pH7.0）稀釋至刻度，加乙腈10 mL，振搖使溶解，精密量取12.5 mL，置50 mL量瓶中，用醋酸鹽緩沖液（pH7.0）稀釋，制成回收對照品溶液（55μg/mL）；另精密稱取克拉霉素原料（浙江國邦藥業有限公司）約11 mg、17.6 mg、22 mg各3份（50%、80%、100%），分別置100 mL量瓶中，加入處方量的輔料，加乙腈10 mL，振搖使溶解，用醋酸鹽緩沖液（pH7.0）稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取12.5ml，置50 mL量瓶中，用醋酸鹽緩沖液（pH7.0）稀釋，制成供試品溶液；吸取回收對照品溶液和供試品溶液各50 μL，注入液相色譜儀，計算回收率。見表3。

表1 標準曲線數據

表2 精密度實驗結果

表3 克拉霉素在醋酸鹽緩沖液（pH7.0）的回收率結果(n=9)

2.9 溶出度曲線對比

取克拉霉素顆粒（生產廠家為湖北華世通潛龍，批號：130813）照中國藥典2015年版溶出度第二法測定，以0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH7.0）900 mL為溶出介質，轉速為50轉/min，分別在以下時間取樣：5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min，濾過。分別量取50μl注入高效液相色譜儀，取克拉霉素對照品溶液（55μg/ml）50μl注入高效液相色譜儀，用峰面積以外標法計算，繪制溶出曲線。同時，按照中國藥典2015年版二部克拉霉素顆粒溶出度方法（硫酸顯色UV比色法檢測），繪制溶出曲線（見圖2）。

圖2 克拉霉素顆粒硫酸顯色UV法與PLC測定結果比較

比較兩種方法的溶出曲線，可明顯的看出HPLC法與UV法存在一定差異。HPLC溶出曲線更加平滑，溶出值更大，更能反應真實的溶出量。

2.10 不同廠家克拉霉素顆粒溶出度測定

取不同廠家的供試品，照中國藥典溶出度第二法檢驗，30min時取樣，濾過，用溶出介質稀釋制成55μg/ml的供試液，注入高效液相色譜儀，計算溶出度。同時與UV比色法的數據進行對比，結果。可以看出，HPLC法，結果準確、差異更小。見表4。

3 結論與討論

通過實驗與查閱文獻[3-5]，總結出克拉霉素顆粒溶出度方法為：取本品，照溶出度測定法（附錄X C第二法），以0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH7.0）（取無水醋酸鈉82 g，加水7500 mL，用冰醋酸調節pH值至7.0，加水使成10000mL）900 mL為溶出介質，轉速為50轉/min，依法操作，30 min時，取續濾液適量，用溶出介質定量稀釋制成55 μg/mL的溶液，作為供試品溶液；精密稱取克拉霉素對照品適量，加少量乙腈溶解，用溶出介質定量稀釋制成55 μg/mL的溶液，作為對照品溶液；照含量測定項下的方法試驗，精密量取上述兩種溶液各50 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算溶出量，限度為80%，僅供參考。

通過溶出度曲線的比較、溶出度測定，都可以明確的看出HPLC法優于UC法。克拉霉素與硫酸反應容易受到外界影響，不同的廠家，不同的批號，濃度上的差異，硫酸放置時間，環境的溫度，反應是否徹底等等，都會對結果產生影響，無法保證試驗的重現性。而HPLC法可以大大節約試驗時間，降低操作過程中人為因素的影響，排除硫酸顯色中過程不穩定因素的影響，避免了由于硫酸反應不完全帶來的干擾， 同時，HPLC法具有準確度高，重復性好的優點。能夠使克拉霉素顆粒溶出試驗更加準確、科學。

表4 克拉霉素顆粒溶出度測定結果

[1] 吳美芳.高效液相色譜法測定克拉霉素片的溶出度[J].中國藥師,2008,12:1525-1526.

[2] 王 巍,曹盛宗,王 勇.高效液相色譜法測定克拉霉素微丸的溶出度[J].海峽藥學, 2010,03:48-50.

[3] 汲 靜,趙甜爽. 高效液相色譜法測定克拉霉素片的溶出度[J].黑龍江科技信息,2013,22:19.

本文編輯：李 豆

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ISSN．2095-8242．2017．13．2393．03