摻M g與接枝RGD的HAnps載體系統對MG63細胞胞吞功能的影響

陳 恬，陳良建，賀惠莉，彭 靜，郭筱慧，鄭雅亦，邵春生

摻M g與接枝RGD的HAnps載體系統對MG63細胞胞吞功能的影響

陳 恬1,2，陳良建1,3，賀惠莉1，彭 靜2，郭筱慧2，鄭雅亦1，邵春生1

(1.中南大學湘雅三醫院，湖南長沙，410013；2.中南大學湘雅醫學院，湖南長沙，410013；3.中南大學粉末冶金國家重點實驗室，湖南長沙，410083)

采用水熱合成法制備HAnps和摻鎂HAnps(Mg-HAnps)，通過硅烷化聯合碳二亞胺法處理HAnps和Mg-HAnps后接枝黏附肽(RGD)，以香豆素6(coumarin-6)為熒光探針標記HAnps，Mg-HAnps，RGD-HAnps和RGD-M g-HAnps，并將其與人成骨肉瘤MG63細胞株(MG63)細胞共培養，研究摻Mg與接枝RGD的HAnps對MG63細胞胞吞作用的影響。研究結果表明：RGD-Mg-HAnps無細胞毒性，摻Mg與接枝RGD有利于MG63細胞胞吞HAnps顆粒，并有協同作用，RGD-Mg-HAnps具有介導胞吞的作用。

基因載體；摻Mg羥基磷灰石納米顆粒(Mg-HAnps)；黏附肽(RGD)；靶向性；胞吞作用

基因治療的關鍵環節是尋找一種合適的載體將目的基因運輸至靶細胞。以羥基磷灰石納米顆粒(Hydroxyapatite nanoparticles，HAnps)為代表的無機(納米)顆粒基因載體具有良好的生物可降解性、制作簡單、易表面改性等優點，但HAnps仍存在轉染效率不高和缺乏靶向性等不足。有研究發現納米顆粒粒徑為20～50 nm，轉染效率較高[1]；摻雜鎂離子的HAnps(Mg-HAnps)表面帶正電荷，有利于結合基因[2]。有研究發現受體?配體介導的方式可提高靶細胞的內吞納米顆粒和顆粒內生化處理能力[3]。黏附肽(RGD)是由精氨酸?甘氨酸?天冬氨酸組成的一段短肽序列，是許多細胞表面的整合素(integrins)的特異性配體[4]，已有研究發現在生物材料表面接枝RGD有利于細胞的黏附、鋪展和增殖[5?7]。在Mg-HAnps表面接枝RGD，能否提高HAnps的膜靶向性和轉染效率，有待于進一步研究。本文作者采用水熱合成法制備HAnps和Mg-HAnps，通過硅烷化聯合碳二亞胺法處理HAnps和Mg-HAnps后接枝RGD，以香豆素6(coumarin-6)為標記HAnps，Mg-HAnps，RGD-HAnps和RGD-Mg-HAnps，并將其與MG63細胞共培養，研究摻Mg與接枝RGD對HAnps的膜靶向性和胞吞作用的影響。

1 材料和方法

1.1 HAnps和M g-HAnps的制備

通過水熱合成法制備HAnps和Mg-HAnps，使(Ca+Mg)與P摩爾比為1.67、Mg與(Ca+Mg)摩爾分數分別為0和7.5%。稱取適量的Ca(NO3)2·4H2O，Mg(NO3)2·6H2O和(NH4)2HPO4分別溶于雙蒸水中，配制濃度均為1mol/L的溶液，并將適量的質量分數為2%的表面活性劑PEG2000加入Ca(NO3)2·4H2O和Mg(NO3)2·6H2O的溶液中。將(NH4)2HPO4以0.12 m L/min的速率滴入混合液中，使用SB?5200DTDN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司生產)震蕩反應前驅物1 h。用氨水調節混懸液至pH=10后，將混懸液轉移至水熱合成反應釜中，于電熱鼓風干燥箱(廣盈儀器有限公司生產，上海，中國)170℃下反應3 h，自然冷卻至室溫，試樣用無水乙醇和雙蒸水交替離心洗滌3次，1 000 r/min，每次5min，棄上清液，保存于無水乙醇中。

1.2 HAnps和M g-HAnps的表征

用X線衍射(XRD)技術對納米顆粒進行物相分析，衍射角為20°＜2θ＜80°，采用Cu Kα射線進行X線衍射分析，工作電壓和電流分別保持在40 kV和250 mA。采用JEM?2100F型場發射高分辨透射電鏡(JEOL，東京，日本)檢測HAnps和Mg-HAnps的形貌、粒徑。

1.3 HAnps和Mg-HAnps接枝RGD

采用硅烷化聯合碳二亞胺法接枝RGD時，配制EDC-MES(質量濃度為5 g/L)，pH=5.5)和RGD-PBS (500μg/m L,pH=7.2)緩沖溶液，將形貌和分散性較佳的HAnps和Mg-HAnps試樣置于以體積比為1:20的APTES的無水乙醇溶液中，超聲振蕩1 h后取出冷卻至室溫。用雙蒸水、無水乙醇交替離心洗滌3～4次，棄上清，浸入EDC-MES緩沖液中超聲振蕩2 h，分別用雙蒸水和MES緩沖液交替離心洗滌3～4次后，浸入RGD-PBS緩沖溶液中反應4 h后取出。用雙蒸水離心洗滌2遍后，置于真空冷凍干燥箱中冷凍干燥24 h，得到RGD-HAnps和RGD-Mg-HAnps粉末。

采用靜電吸附法制備接枝RGD時，稱取一定量的Mg-HAnps粉末于離心管中，加入RGD-PBS(500 μg/m L，pH=7.2)緩沖溶液，保持Mg-HAnps濃度與上述操作一致。室溫下超聲振蕩1 h，靜置4 h后，用雙蒸水離心洗滌2次，置于真空冷凍干燥箱中冷凍干燥24 h。

1.4 RGD-HAnps的XPS檢測

表面接枝RGD可引入Mg-HAnps本身不含的N元素，故采用ESCALAB 250XiXPS光電子能譜儀檢測各原子數分數和化學鍵，通過擬合C元素峰，檢測C元素化學鍵存在形式，以此判斷RGD是否成功接枝。

1.5 香豆素6(Coum arin-6)標記RGD-M g-HAnps及

檢測

配制質量濃度為0.30mg/m L的Coumarin-6的無水乙醇溶液，配制成質量濃度為0.05 g/m L的RGD-Mg-HAnps混懸液，在超聲清洗機中超聲振蕩40 min(功率為100W)后靜置12 h。以1 000 r/min離心5 min，去上清，用無水乙醇、雙蒸水分別離心洗滌3次，儲存于雙蒸水中。用巴氏管吸取少量混懸液，滴于24孔板中，于倒置熒光顯微鏡下觀察其熒光特性。

1.6 M TT法檢測RGD-M g-HAnps的細胞毒性

1.6.1 RGD-Mg-HAnps混懸液的制備

將稱量好的RGD-Mg-HAnps在等離子消毒機中消毒后，于超凈工作臺下用培養液(已滅活小牛血清與1640培養液體積比為1:9)配制成混懸液，質量濃度分別為0.10，0.25，0.50，0.75，1.00，1.50和2.00mg/m L，共7組，置于EP管中，在細胞培養箱中放置浸提72 h，于4℃保存。

1.6.2 培養及檢測

式中：R為相對增殖率；Atest為試驗組平均吸光度；Af為陰性對照組平均吸光度。根據細胞的相對增殖率評定材料的細胞毒性程度分級。

表1 細胞毒性分級Table1 Cytotoxic grading

1.7 評價HAnps對MG 63細胞胞吞的影響

1.7.1 MG63細胞的培養

MG63細胞成功復蘇后置于37℃下體積分數5% CO2培養箱內培養，每隔48 h更換一次培養液，培養液由已滅活的小牛血清和RPM I1640培養基按體積比1:9配置而成。于倒置顯微鏡下觀察，培養瓶內細胞覆蓋超過80%，即用0.25%胰蛋白酶液消化，將其分別接種到2個培養瓶進行傳代培養。

1.7.2 不同處理方法與濃度的HAnps與MG63細胞共培養

共培養實驗組設置HAnps,Mg-HAnps,RGDHanps，RGD-Mg-HAnps4組，均已標記Coumarin-6，每組再設100，300和500μg/m L等3種質量濃度，對照組為空白組。將不同方法處理的HAnps與10%胎牛血清的gibco RPM I-1640培養液配置成質量濃度為100，300和500μg/m L的混懸液。將MG63細胞用0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的gibco RPM I1640培養液終止消化，配置成5×104個/m L的細胞懸液，接種于24孔板中，每孔0.5m L，放置在37℃下5% CO2細胞培養箱中培養24 h待完全貼壁后，以HAnps混懸液替代原培養液，1號板為HAnps組，設置1～3號孔，用濃度分別為100，300和500μg/m L的HAnps混懸液100μL替代原培養液，4號孔更換為新鮮的培養液為空白對照組，設4個復孔，完成換液后置于培養箱中繼續培養24 h，取出后用PBS洗滌，在倒置顯微鏡下對比白光與熒光顯微鏡下圖像，觀察MG63細胞的胞吞情況。2～4號板分別為Mg-HAnps組、RGD-HAnps組和RGD-Mg-HAnps組，實驗方法與1號板的相同。

2 結果

2.1 XRD及TEM檢測結果

圖1所示為HAnps和摻7.5%Mg-HAnps的XRD圖譜。由圖1可看出：HAnps和Mg-HAnps均出現了HAnps晶體的特征衍射峰(JCPDS No.9-0432)；但HAnps和Mg-HAnps的主波峰和次波峰均降低、寬化，在12°，27°，32°和44°處，實驗組樣品均出現了新的波峰，而HAnps在這些位置則無波峰，結果表明：Mg2+摻入了HAnps中。

我們本該明白教育應做什么：智育是要發展好奇心和理性思考的能力，而不是灌輸知識；德育是要鼓勵崇高的精神追求，而不是鼓吹規范；美育是要培育豐富的靈魂，而不是傳授技藝。

圖1 HAnps和Mg-HAnps的XRD圖譜Fig.1 XRD patternsof HAnpsand Mg-HAnps

透射電鏡(TEM)下觀察HAnps和Mg-HAnp形貌如圖2所示。從圖2可看出：HAnps的顆粒形貌以桿狀為主，而Mg-HAnps顆粒有桿狀和細針狀2種形貌，2組顆粒的粒徑均在50～100 nm范圍內。

2.2 RGD-Mg-HAnps的XPS檢測結果

圖2 HAnps和M g-HAnps的TEM圖Fig.2 TEM imagesof HAnpsand Mg-HAnps

圖3 RGD-Mg-HAnps中C元素峰XPS擬合解析圖Fig.3 Fitting analytic graph of carbon element peak of RGD-Mg-HAnps prepared by XPS

圖3 所示為RGD-Mg-HAnps的C元素峰XPS擬合解析圖。可見：采用硅烷化聯合碳二亞胺法接枝RGD時，C元素以C—C鍵、C—H鍵、C—N鍵和N—C=O鍵等的形式存在；采用靜電吸附法接枝RGD時，C元素以C—C鍵、C—H鍵、C—N鍵和O—C=O鍵等形式存在。O—C=O鍵為RGD多肽內固有的化學鍵，說明RGD與Mg-HAnps之間未形成新的化學鍵，而硅烷化聯合碳二亞胺法接枝的RGD-Mg-HAnps中出現了N—C=O鍵，說明RGD與硅烷化聯合碳二亞胺法處理后的Mg-HAnps表面形成化學鍵的結合，RGD已成功地接枝Mg-HAnps表面。

2.3 RGD-Mg-HAnps的細胞毒性試驗

用MTT法檢測不同濃度的RGD-Mg-HAnps的細胞毒性，圖4所示為RGD-Mg-HAnps與L929細胞共培養48 h后在倒置顯微鏡照片，(a)～(d)組為實驗組，(e)為陰性對照組，(f)為陽性對照組。從圖4可看出：(a)～(e)組細胞呈星形鋪展，形態和貼壁良好，實驗組與陰性對照組比較，在細胞數目和形態方面無明顯差異，而(f)組已完全裂解，失去正常的形態和結構，呈殘渣和碎片樣表現。

表2所示為RGD-Mg-HAnps在0.10～2.00mg/m L對L929小鼠成纖維細胞的細胞毒性結果。由表2可知：實驗組的相對增殖率與陽性對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，各組細胞毒性分級均為0～1級，表明RGD-Mg-HAnps在0.10～2.00mg/m L范圍內對L929細胞均無毒性，滿足GB/T 16886.5—2003“醫療器械生物學評價國家標準”中對生物材料的細胞毒性要求。

表2 RGD-Mg-HAnps的細胞毒性評價Table2 Cytotoxic evaluation of RGD-Mg-HAnps

2.4 不同處理方法與濃度的HAnps對MG 63細胞胞吞作用的影響

圖4 RGD-Mg-HAnps與L929細胞共培養48 h的倒置顯微鏡照片Fig.4 Imagesof inverted m icroscope of L929 cells co-cultured w ith RGD-M g-HAnps for 48 h

Coumarin-6標記的HAnps,Mg-HAnps,RGDHAnps和RGD-Mg-HAnps分別與MG63細胞共培養24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察胞內熒光強弱，比較不同濃度的納米顆粒、摻Mg和接枝RGD對MG63細胞胞吞HAnps的影響。圖5所示為Coumarin-6標記的HAnps與MG63共培養24 h的倒置熒光顯微鏡照片。從圖5可以看出：不同濃度的HAnps與MG63細胞共培養，在同一時間點觀察MG63細胞內的熒光強度不同，納米顆粒濃度增加，胞內的熒光強度也有所增加，但增加不明顯。圖6所示為Coumarin-6標記的Mg-HAnps與MG63共培養24 h的倒置熒光顯微鏡照片。可見：隨著Mg-HAnps的濃度增加，MG63細胞內的熒光濃度增加，在相同納米顆粒濃度和共培養時間條件下，比較圖6與圖5中MG63細胞胞內熒光強度可發現，Mg-HAnps組對細胞胞吞的促進作用優于HAnps組對細胞胞吞的促進作用。圖7所示為Coumarin-6標記的RGD-HAnps與MG63共培養24 h的倒置熒光顯微鏡照片。可見：接枝RGD的HAnps與MG63細胞共培養24 h后觀察，MG63細胞胞內有熒光的細胞數量和胞內熒光強度隨納米顆粒的濃度增加而增加。圖8所示為Coumarin-6標記的RGD-Mg-HAnps與MG63細胞共培養24 h的倒置熒光顯微鏡照片。從圖8可看出：不同濃度RGD-Mg-HAnps與MG63細胞共培養，在同一時間點觀察，視野內的MG63細胞的胞漿內均有綠色熒光存在，納米顆粒濃度增加，MG63細胞的胞漿內熒光強度增加不明顯。

由此可知：在相同濃度和培養時間下，HAnps，Mg-HAnps，RGD-HAnps和RGD-Mg-HAnps組分別與MG63細胞共培養24 h后觀察胞漿內有熒光的細胞數量和熒光強度明顯不同，表明MG63細胞胞吞納米顆粒的數量不同。RGD-Mg-HAnps組中MG63細胞胞漿內有熒光的細胞數量最多，熒光強度也明顯優于其他3組，RGD-HAnps組對細胞胞吞的促進作用優于Mg-HAnps組和HAnps組對細胞胞吞的促進作用。結果表明，對HAnps進行摻Mg與表面接枝RGD處理均能促進MG63細胞胞吞HAnps，摻Mg后再接枝RGD的HAnps更有利于MG63細胞胞吞作用。

圖5 Coumarin-6標記的HAnps與MG63共培養24 h的倒置熒光顯微鏡照片Fig.5 Inverted fluorescencemicroscope of HAnpswith Coumarin-6 co-culturedw ith MG63 for24 h

圖6 Coumarin-6標記的Mg-HAnps與MG63共培養24 h的倒置熒光顯微鏡照片Fig.6 Inverted fluorescencem icroscope of Mg-HAnpsw ith Coumarin-6 co-cultured w ith MG63 for 24 h

3 討論

基因載體主要有病毒載體和非病毒載體兩大類，其中病毒載體轉染效率高，但存在致癌、免疫原性、細胞毒性等潛在風險[8]，所以臨床應用受限。與病毒載體相比，非病毒載體轉染效率低，但其優勢如下：毒性低、免疫反應低；所攜帶的基因不整合至宿主細胞基因組；材料來源廣泛，化學結構可控制，便于大量制備；沒有載體容量限制等。非病毒基因載體主要有陽離子多聚物、無機納米顆粒、脂質體，樹狀聚合物等。其中陽離子多聚物(如PEI和PLL)表面富含正電荷，轉染效率與相對分子質量成正比，但細胞毒性會隨多聚物相對分子質量增加而增加[9]。脂質體為類細胞結構，易與血漿蛋白結合，易被自身免疫系統識別并清除，且具有一定的細胞毒性[10]。無機納米顆粒是由無機材料制成的納米結構顆粒，如HAnps、金納米顆粒、磁性納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、氧化鐵納米顆粒、量子點納米顆粒、碳納米管等。HAnps已被證明是基因轉染的有效的非病毒載體[11?13]，HA是牙齒和骨骼中天然的無機成分，具有優異的生物相容性和獨特的生物功能；在pH為7.4的生理環境中不降解，而在pH低于6.5的胞吞小泡和溶酶體內降解，沒有細胞毒性及免疫原性[14?17]。但HAnps還存在著轉染效率不高和缺乏靶向性等不足，因而提高HAnps載體系統的轉運效率和靶向性是研究熱點。

HAnps的基因轉染效率受粒徑、表面電荷與界面形貌、Zeta電位和局部微環境等因素的影響[1]。在HAnps的結晶中摻雜能改變顆粒的理化特性[18]。有研究發現：在溶液環境中原子半徑為0.09～0.13 nm的陽離子較容易取代鈣離子(半徑為0.1 nm)，Mg2+的離子半徑恰處于這范圍之中，且具有抑止HAnps顆粒晶粒長大的作用，有利于控制HAnps的粒度[19?20]；同時，鎂元素是人體不可缺少的微量元素，摻雜Mg2+的HAnps表面帶有正電荷，與DNA或RNA結構上磷酸基團的靜電相互作用，有利于基因結合[21]。本研究通過控制工藝參數制備出平均粒徑約為70 nm的分散性良好的Mg-HAnps，符合細胞胞吞納米顆粒的粒徑要求，摻Mg組與未摻Mg組分別與MG63細胞共培養，比較結果可知：摻Mg組MG63細胞胞漿內的熒光強度優于未摻Mg組，從而表明摻Mg的HAnps有利于MG63細胞的胞吞作用。

表面接枝改性是提高HAnps載體系統轉染效率和靶向性的策略之一。有研究發現受體?配體介導能提高靶細胞的內吞納米顆粒和顆粒內生化處理能力[3]。整合素家族是細胞表面受體的主要家族，通過募集整合素特異性配體，介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質(ECM)之間許多重要的細胞功能，包括黏附、遷移、侵入等，并介導細胞與ECM之間的雙向信號傳導[6]。選擇黏附肽(RGD)作為接枝材料，RGD是由精氨酸?甘氨酸?天冬氨酸組成的一段短肽序列，是許多細胞表面的整合素(integrins)的特異性配體，RGD能與成骨細胞胞膜上的α1β1和α5β1等整合素受體結合[22?24]。用硅烷化聯合碳二亞胺法在HAnps表面接枝RGD后，選用HAnps，Mg-HAnps，RGD-HAnps和RGD-Mg-HAnps組分別與MG63細胞共培養24 h后發現，當納米顆粒濃度和培養時間相同時，MG63細胞胞漿內有熒光的細胞數量和熒光強度明顯不同，接枝RGD組的胞內有熒光的細胞數和熒光強度均優于未接枝組，提示接枝RGD可促進HAnps的胞吞作用。另外，接枝RGD組與摻Mg組也有不同，摻Mg2+和接枝RGD組的MG63細胞胞漿內有熒光的細胞數目和熒光強度明顯高于僅摻Mg組或僅接枝RGD組，摻Mg和接枝RGD對促進MG63細胞胞吞HAnps有協同作用，其可能的原因如下：RGD是細胞表面整合素配體，能與細胞表面黏附分子的受體識別結合，在納米顆粒表面接枝RGD，能通過受體?配體介導，提高納米顆粒靶向細胞膜作用；摻Mg2+的HAnps表面帶正電荷，而細胞膜表面帶負電荷，兩者間的靜電吸引作用，有利于納米顆粒向細胞表面遷移，通過靜電吸引和受體?配體介導發揮協同作用，促進細胞對納米顆粒的胞吞作用。

圖7 Coumarin-6標記的RGD-HAnps與MG63共培養24 h的倒置熒光顯微鏡照片Fig.7 Inverted fluorescencemicroscopeof RGD-HAnpswith Coumarin-6 co-culturedw ith MG63 for24 h

圖8 Coumarin-6標記的RGD-Mg-HAnps與MG63共培養24 h的倒置熒光顯微鏡照片Fig.8 Inverted fluorescencem icroscope of RGD-M g-HAnpsw ith Coumarin-6 co-cultured w ith MG63 for 24 h

4 結論

1)通過控制水熱合成法工藝參數和摻Mg能控制HAnps的形貌和粒徑，制備桿狀粒徑均在50～100 nm范圍的Mg-HAnps。

2)硅烷化聯合碳二亞胺法接枝的RGD-Mg-HAnps在0.10～2.00mg/m L范圍內無細胞毒性。

3)摻Mg與表面接枝RGD均能促進MG63細胞的胞吞HAnps，摻Mg和表面接枝RGD能發揮協同作用，更有利MG63細胞胞吞HAnps。

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(編輯 趙俊)

Influence of HAnps carrier system w ith doping M g and grafting RGD on endocytosisof MG63 cells

CHEN Tian1,2,CHEN Liangjian1,3,HEHuili1,PENG Jing2,GUO Xiaohui2, ZHENG Yayi1,SHAOChunsheng1

(1.Third Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410013,China; 2.X iangya School of Medicine,Central South University,Changsha 410013,China; 3.State Key Laboratory of Pow derM etallurgy,Central South University,Changsha 410083,China)

HAnps and HAnps w ith doped M g(Mg-HAnps)w ere prepared by hydrothermal synthesismethod(HTSM), grafted adhesive peptide(RGD)after silanization combined w ith carbodiim ide method,labeled HAnps,M g-HAnps, RGD-HAnps,RGD-Mg-HAnpswith coumarin-6 asa fluorescent label,and theywere co-culturedw ith human osteosarcoma MG63 cell line(MG63)cells.The effectsof HAnpsw ith doping Mg and grafting RGD on endocytosisof MG63 cellswere investigated.The results show that RGD-M g-HAnps have no cytotoxicity.M g-doped and RGD-grafted HAnps im prove endocytosisofMG63 cells,which have synergistic effects.RGD-Mg-HAnps areable to promote endocytosis.

gene vector;Mg-doped Hydroxyapatite nanoparticles(Mg-HAnps);arginine-glycine-aspartic acid(RGD); targeting specificity;endocytosis

R783.1

A

1672?7207(2017)03?0625?10

10.11817/j.issn.1672-7207.2017.03.010

2016?10?20；

2016?12?12

國家自然科學基金資助項目(81571021)；湖南省科技重點項目(2015WK3012)；中南大學湘雅三醫院新湘雅人才項目(20160301)；湖南省高層次衛生人才“225”工程骨干人才項目(225)；中南大學本科生自由探索計劃項目(ZY2016758)；中南大學粉末冶金國家重點實驗室資助項目(621020094)(Project(81571021)supported by the National Natural Science Foundation of China;Project (2015WK3012)supported by the Hunan Provincial Science and Technology Department Program;Project(20160301)supported by the New Xiangya Talent Program of the Third Xiangya Hospital of Central South University;Project(225)supported by the High Level Health Personnel in Hunan Province,China;Project(ZY2016758)supported by the Undergraduate Free Exploration Program in Central South University; Project(621020094)supported by State Key Laboratory of Powder Metallurgy in CentralSouth University)

陳良建，博士，教授，主任醫師，從事牙種植體修復、頜骨缺損的贗復體修復及新型肽種植體的研究；E-mail:jian007040@sina.com