芳香烴受體在心房顫動患者心房組織中的表達及意義*

雷建明， 肖 驊， 李 強， 魏 瀟， 郭靜文， 肖銘漢

(重慶醫科大學附屬第一醫院心血管內科， 重慶 400016)

芳香烴受體在心房顫動患者心房組織中的表達及意義*

雷建明， 肖 驊△， 李 強， 魏 瀟， 郭靜文， 肖銘漢

(重慶醫科大學附屬第一醫院心血管內科， 重慶 400016)

目的： 檢測芳香烴受體(AhR)在風濕性心臟病(風心病)心房顫動患者右心耳組織中的表達，探討其在心房纖維化中的作用及意義。方法: 取風心病換瓣手術患者的右心耳組織為實驗組，其中風心病竇性心律組25例和風心病慢性房顫組11例；取先天性心臟病(先心病)心臟手術患者的右心耳組織12例作為對照組。采用Masson染色法檢測右心耳組織膠原含量，采用免疫組化技術檢測AhR、AhR核轉位蛋白(ARNT)和CYP1A1蛋白的表達和分布，采用實時熒光定量PCR檢測AhR、ARNT和CYP1A1的mRNA表達,采用Western blot檢測AhR、ARNT和CYP1A1的蛋白表達。 結果: 與先心病組相比, 風心病竇律組和風心病慢性房顫組膠原含量和AhR、ARNT、CYP1A1的表達明顯增高；與風心病竇律組相比，風心病慢性房顫組膠原含量和AhR、ARNT、CYP1A1的表達明顯增高(P<0.05)。結論: 風心病患者心房組織中AhR 的表達與纖維化程度相關； AhR/ARNT/CYP1A1在風心病患者中表達增加,可能參與風心病心房纖維化的發生發展。

芳香烴受體； 心房顫動； 纖維化

心房顫動(atrial fibrillation，AF)簡稱房顫，是臨床上最常見的心率失常之一，發病率和死亡率隨年齡逐漸增加，尤其合并卒中和心衰等并發癥時更高[1]。引起房顫最常見的原因是風濕性心臟病(rheumatic heart disease, RHD)，該病極易引起瓣膜病變，進而引發房顫[2]。房顫的發生過程中存在結構重構，心房纖維化是結構重構最突出的特征，然而心房纖維化的具體機制還不明確[3]。

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一種配體激活性轉錄蛋白，激活后與AhR核轉位蛋白(AhR nuclear translocator,ARNT)結合，可調節細胞色素酶P450家族成員之一CYP1A1的表達[4-5]。有研究表明激活AhR可誘導小鼠肝纖維化[6]。AhR在人體直腸等部位有表達且發揮作用[7]，但在心房中是否表達發揮作用卻未見報道。為此，我們收集先心病與風心病患者在體外循環手術中收集右心耳標本，檢測組織膠原含量與AhR的表達，探討AhR在心房纖維化中作用，為房顫的相關防治提供新的方向。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 研究對象 在這項研究中總共選入了48位患者，男17例，女31例，平均年齡為(42.77±14.24)歲。這些患者都是在2015.04～2016.03期間在重慶醫科大學附屬第一醫院進行體外循環手術，排除合并有冠心病、高血壓以及糖尿病的患者。將患者分成3組：先天性心臟病(congenital heart disease, CHD)竇性心律(CHD+sinus rhythm)組12例；RHD竇性心律(RHD+sinus rhythm)組25例；RHD持續性房顫(RHD+cAF)組11例。術前通過超聲心動圖檢測左室前后徑、左室舒張末徑、右房橫徑和射血分數。在進行研究之前，均已通過患者或患者家屬簽字同意。所有知情同意書以及協議都通過了本院倫理委員會批準。

1.2 右心耳組織取樣 在體外循環手術進行時，于手術室外即時接收體外循環手術中剪除的右心耳組織 約100 mg。將右心耳組織用冰盒運送至實驗室，以生理鹽水清洗，錫箔紙包裹，放入凍存管于-80 ℃保存。

1.3 主要試劑 抗 AhR和CYP1A1抗體(Abcam);抗ARNT抗體(CST);抗β-actin抗體(Proteintech)；總RNA提取試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒以及AhR、ARNT、CYP1A1和β-actin的引物(TaKaRa)；Masson染色試劑盒(南京建成科技有限公司)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

2 主要方法

2.1 Masson染色 使用Masson染色試劑盒進行Masson染色。石蠟切片脫蠟，入95%、70%、30%乙醇各2 min，蒸餾水2 min。40 ℃水中漂洗2次，各30 s。R1核染液染色60 s，沖洗液沖洗30 s。R2漿染液染色60 s，沖洗液沖洗30 s。R3黃色讓葉分色8 min，棄去分色液。R4藍色復染液染色5 min，無水乙醇沖洗干凈。中性樹脂封固，鏡下觀察拍照。每張切片在顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×200)。用Image-Pro Plus 6.0軟件，測定膠原容積分數(collage volume fraction，CVF)=(膠原面積/所測視野面積)，取平均值。

2.2 免疫組化 采用免疫組化方法檢測組織中蛋白表達情況。組織固定后，脫水切片，烘烤，泡缸，用SP9001處理進行組化操作，孵 I 抗AhR(1∶100)、ARNT(1∶100)和CYP1A1(1∶50)。4 ℃過夜，孵 II 抗，DAB顯色，蘇木精染色，晾干，封片，顯微鏡下觀察拍照。每張切片在顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400)。

2.3 Western blot 組織蛋白稱重記錄后放入勻漿管，在冰上剪碎組織。RIPA+PMSF(100∶1)裂解組織30 min，4 ℃離心5 min，收取上清液，BCA法測定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離、電轉至PVDF膜(Millipore)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，I 抗(AhR 1∶2 000，ARNT 1∶1 000，CYP1A1 1∶100，β-actin 1∶1 000)4 ℃孵育過夜，IgG II 抗(1∶7 500)室溫孵育1 h，ECL法顯色。以β-actin作為內參照。電泳條帶灰度值使用實驗室儀器自帶軟件Image Lab (Bio-Rad)進行分析，以目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達量。

2.4 實時熒光定量PCR 將右心房組織在冰上勻漿裂解，用總RNA提取試劑根據說明書提取總RNA。用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄。在實驗室機器(Lab7500)上進行10 μL體系擴增。引物序列見表1。以β-actin為內參照。反應體系10 μL，PCR擴增條件為：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s，60 ℃(AhR、ARNT和CYP1A1)/62 ℃(ANP)退火30 s，40個循環; 65 ℃緩慢升高至95 ℃，每5 s增加0.5 ℃，分析熔解曲線。擴增得到的Ct值使用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。

3 統計學處理

使用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料用均值±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法。以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列

結 果

1 患者分組及一般情況

與先心病竇律組相比，風心病竇律及房顫組年齡、左房前后徑、左室舒張末徑明顯增加，右房橫徑明顯減小；與風心病竇律組相比，風心病持續性房顫組左房前后徑明顯增加，右房橫徑明顯增大(P<0.05)。射血分數在3組間并無顯著差異，見表2。

表2 患者一般情況及超聲心動圖結果

LAD: left atrial dimension; LVEDD: left ventricular end-diastolic dimension; RAD: right atrial dimension; LVEF: left ventricular ejection fraction.*P<0.05vsCHD+sinus rhythm;#P<0.05vsRHD+sinus rhythm.

2 組織膠原容積分數

風心病持續性房顫組心房組織CVF比風心病竇律患者組及先心病竇律組明顯增高，風心病竇律組CVF值比先心病竇律患者組明顯增高(P<0.05)，見圖1。

3 AhR/ARNT/CYP1A1在組織中的分布

AhR/ARNT/CYP1A1蛋白在3組患者組織中均有表達，3種蛋白主要分布于胞漿。與先心病竇律組相比，風心病竇律組及持續性房顫組表達增加，其中持續性房顫組增加更為明顯，見圖2。

4 AhR/ARNT/CYP1A1的蛋白表達

與先心病竇性心律組相比，AhR、ARNT和CYP1A1表達水平在風心病竇律組及風心病持續性房顫組明顯升高；與風心病竇律組相比，風心病持續性房顫組明顯升高(P<0.05)，見圖3。

5 AhR/ARNT/CYP1A1 的mRNA相對表達

AhR/ARNT/CYP1A1在風心病房顫組與風心病竇律組中的mRNA表達都顯著高于先心病竇律組，風心病持續性房顫組AhR/ARNT/CYP1A1的mRNA表達水平都明顯高于風心病竇律組(P<0.05)，見圖4。

6 相關性分析

AhR在風心病患者中的蛋白表達水平與CVF呈正相關(r=0.67，P<0.05)；AhR蛋白表達與ARNT蛋白表達呈正相關(r=0.941，P<0.01)；AhR與CYP1A1蛋白表達呈正相關(r=0.939，P<0.01)。

Figure 1.Determination of collagen volume fraction (CVF) in different groups by Masson’s trichrome staining (×200). Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCHD+sinus rhythm;#P<0.05vsRHD+sinus rhythm.

圖1 膠原染色結果

Figure 2.Immunohistochemical analysis of AhR, ARNT and CYP1A1 in CHD+sinus rhythm group, RHD+sinus rhythm group and RHD+cAF group (×400). Brown or yellow stained proteins mainly distributed throughout the cytoplasm of myocardial cells, and their expression increased gradually.

圖2 免疫組化結果

Figure 3.Comparison of the relative protein expression of AhR, ARNT and CYP1A1 among groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCHD+sinus rhythm;#P<0.05vsRHD+sinus rhythm.

圖3 蛋白表達結果

討 論

近年來，房顫的發病率和死亡率逐漸升高，造成了巨大的社會負擔[8]。繼發于風濕性心臟病的房顫很常見，它能夠損害心功能、增加體循環栓塞的風險[2]。在將來房顫會有更高的發病率[9]。

心房纖維化是房顫最顯著的結構改變[3]。在本研究中心房組織纖維化程度在先心病竇律組、風心病竇律組、房顫組逐漸升高，左房舒張末徑也相應增大，同樣說明心房纖維化與房顫相關。此發現與Zhang等[10]、Li等[11]的實驗結果符合。何文聰等[12]在研究纖維化與縫隙連接重構關系時也有類似發現。風心病房顫組右房橫徑比風心竇律組明顯增高，說明房顫加深心房病變，而先心病組右房橫徑更高，原因可能是大部分入選先心病人為房間隔缺損，且年齡較大。這些病人，右房比風心病組更大，心率卻是竇律，心房纖維化程度較低，這進一步說明房顫與纖維化密切相關。

Figure 4.Comparison of the relative mRNA expression of AhR, ARNT and CYP1A1 among groups. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCHD+sinus rhythm;#P<0.05vsRHD+sinus rhythm.

圖4 各組mRNA比值

近期研究發現 AhR參與細胞分化、組織重構、免疫調節等過程[13]。AhR/ARNT/CYP1A1是一經典通路，參與纖維化等多種調節。Poormasjedi-Meibod等[14]研究表明在真皮成纖維細胞中AhR/ARNT/CYP1A1參與纖維化。Antos等[15]研究發現TCDD刺激AhR/ARNT/CYP1A1在卵巢中表達增加，發現了通過CYP1A1作為靶點解毒的可能性。涉及AhR的基礎研究大部分都是以動物作為模型[16-17]，本研究首次在人體心臟組織中發現AhR的表達，且發現在風心病患者中表達顯著高于先心病患者，提示AhR可能也是心臟疾病的一個重要因素。在本研究中AhR的表達在先心病竇律組、風心病竇律組、風心病慢性房顫組中逐漸升高，與心房纖維化程度一致。這也與Pierre等[6]在TCDD刺激小鼠肝臟細胞纖維化后，AhR蛋白及mRNA表達增加的結果相符。Xue等[17]也在研究中發現AhR參與調節小鼠胰腺纖維化。這些研究結果提示AhR可能參與心房纖維化的發生發展。ARNT是AhR核轉運蛋白，是AhR相關信號通路的一個重要部分，許多基因調控都是通過AhR/ARNT介導的[18-20]。本研究中在3個組ARNT蛋白表達趨勢與AhR趨勢相同，呈正相關。提示AhR可能是通過介導ARNT參與心房纖維化。CYP1A1是細胞色素酶P450家族成員之一，在化學物質代謝中起著重要作用，也是AhR/ARNT的一個下游調控基因[19]。Yaming等[21]研究發現CYP1A1基因在口腔黏膜下層纖維化中起重要作用，Ghosh等[22]也發現CYP1A1增加口腔黏膜下層纖維化的風險。本研究中，纖維化組織中CYP1A1蛋白表達趨勢與AhR/ARNT蛋白表達趨勢相一致，呈正相關。提示CYP1A1可能是AhR下游調控心房纖維化的關鍵環節，可能成為治療風心病房顫患者防治心房纖維化的重要靶點。

綜上所述，AhR/ARNT/CYP1A1信號通路可能參與了風心病房顫患者心房纖維化的發生發展。本研究證實了AhR在人體心房組織中的表達，并發現AhR的表達與組織纖維化程度相關，擴充了在人體心臟領域中對AhR的研究，豐富了心房纖維化的可能發生機制，也為房顫的藥物防治提供新的理論基礎。在后續的實驗中，我們將進行細胞水平實驗，并且繼續收集標本，收取足夠的風心病陣發性房顫病例作為風心病陣發性房顫組。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Expression and significance of aryl hydrocarbon receptor in atrial tissues of patients with atrial fibrillation

LEI Jian-ming, XIAO Hua, LI Qiang, WEI Xiao, GUO Jing-wen, XIAO Ming-han

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:xiaohua197408@163.com)

AIM: To investigate the expression of aryl hydrocarbon receptor (AhR) in atrial tissues of the patients with rheumatic heart disease (RHD), and the effects of AhR on rheumatic atrial fibrosis. METHODS: Right atrial specimens obtained from the patients with RHD requiring valve replacement surgery were divided into chronic atrial fibrillation (RHD+cAF,n=11) group and sinus rhythm (RHD+sinus rhythm,n=25) group. The patients with congenital heart disease (CHD) and sinus rhythm (CHD+sinus rhythm,n=12) who underwent heart surgery served as controls. The collagen volume fraction in the atrial specimens was examined by Masson’s trichrome staining. The protein expression and distribution of AhR, AhR nuclear translocator (ARNT) and CYP1A1 were detected by the methods of immunohistochemistry and Western blot. The mRNA expression of AhR, ARNT and CYP1A1 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. RESULTS: Compared with CHD+sinus rhythm group, the collagen content and the expression of AhR, ARNT and CYP1A1 were significantly increased in RHD+sinus rhythm group and RHD+cAF group. Compared with RHD+sinus rhythm group, the collagen content and the expression of AhR, ARNT and CYP1A1 were significantly increased in RHD+cAF group (P<0.05). CONCLUSION: The expression of AhR is correlated with the degree of fibrosis. The expression of AhR/ARNT/CYP1A1 is increased in atrial tissues of patients with RHD, suggesting that AhR/ARNT/CYP1A1 should be involved in atrial fibrosis of the patient with RHD.

Aryl hydrocarbon receptor; Atrial fibrillation; Fibrosis

1000- 4718(2017)05- 0826- 06

2016- 12- 19

2017- 03- 16

國家自然科學基金資助項目(No. 81300140)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.010

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