阿司匹林誘生型脂氧素A4對小鼠脊髓撞擊損傷后神經病理性疼痛的影響及機制探討

郭云翮，李祥，米衛東

（山西大同大學醫學院外科教研室，山西大同037009）

阿司匹林誘生型脂氧素A4對小鼠脊髓撞擊損傷后神經病理性疼痛的影響及機制探討

郭云翮，李祥，米衛東

（山西大同大學醫學院外科教研室，山西大同037009）

目的評估阿司匹林誘生型脂氧素A4（ATL）對小鼠脊髓損傷（SCI）模型中神經炎癥和神經病理痛的影響。方法成年FVB小鼠T10節段脊髓進行改良Allen'脊髓撞擊損傷。小鼠隨機分成ATL組和Vehicle組，分別在SCI手術后4和24 h鞘內注射ATL（300 pmol）或vehicle。采用von Frey方法評估兩組小鼠后腳機械刺激的敏感性；采用PCR方法檢測兩組小鼠脊髓小膠質細胞標記物和細胞因子信使核糖核酸（mRNA）表達；此外，通過小鼠大腦皮層組織小膠質細胞培養來評估ATL對小膠質細胞的激活和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）釋放的直接影響。結果與Vehicle組小鼠比較，ATL處理導致SCI誘導的小鼠機械痛敏降低；脊髓小膠質細胞標記物和促炎性細胞因子mRNA水平也下降。而且，ATL處理對小膠質細胞標記物IBA-1和促炎性因子TNF-α表達影響。此外，原代皮層小膠質細胞表達ATL相應受體ALX，ATL通過ALX發揮抗炎作用。結論ATL通過ALX受體調節小膠質細胞激活和TNF-α釋放，最終降低小鼠SCI后神經病理性疼痛。

阿司匹林誘生型脂氧素A4；脊髓損傷；神經病理性疼痛；小鼠

脊髓損傷（Spinalcordinjury，SCI）是一種常見的損傷，全球范圍內患病率約為40/10 000～80/10 000[1]。大約40%～50%SCI患者在損傷1年內產生神經病理性疼痛[2]。目前，臨床上對神經病理性疼痛治療主要通過調節神經元上鈉和鈣通道，以及N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）和γ-氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）受體，但治療效果有限[3]。近年來研究表明，神經病理性疼痛產生不僅涉及神經元，也與免疫系統和神經膠質細胞，如星形膠質細胞和小膠質細胞有關[4]。SCI后激活的小膠質細胞和星形膠質細胞，均可釋放趨化因子和細胞因子，導致脊髓炎癥反應。越來越多證據表明，抑制脊髓炎癥反應可緩解SCI誘導的神經病理性疼痛[5]。

阿司匹林誘生型脂氧素A4（aspirin-triggered lipoxin A4，ATL）是二十烷類家族中一類氨基酸代謝產物，具有典型的三羥基、四共軛雙鍵結構。ATL是機體內產生的抗炎脂類介質，參與抑制機體內各種炎癥[6]。有研究表明，大鼠鞘內注射ATL，主要通過與星形膠質細胞上ALX受體結合，抑制炎癥細胞因子表達，從而緩解慢性坐骨神經壓迫損傷（chronic constriction injury，CCI）誘導的神經病理性疼痛[7]。然而，ATL在小鼠SCI模型中的作用仍未見相關報道。因而，本研究目的是探討ATL在小鼠脊髓撞擊損傷后的抗炎鎮痛作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性FVB小鼠（25～30 g）購于山西醫科大學實驗動物中心。室溫下自由飲食和飲水。將FVB小鼠隨機分成：Sham組、（SCI+ATL）組和（SCI+Vehicle）組，每組6只。

1.2 實驗儀器和試劑

ATL（美國Sigma公司），γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ)（美國Sigma公司），酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、兔抗P-p38MAPK多克隆抗體（美國Sigma公司），DMEM/F12培養基（湖北省武漢博士德生物工程有限公司），腦立體定位儀（香港友誠生物科技有限公司），ALX siRNA及聚合酶鏈式反應引物（上海生工生物工程有限公司和上海英駿公司合成）。

1.3 方法

1.3.1 小鼠SCI模型復制首先將腦立體定位儀持物桿取下，以10 g砝碼的重物打擊桿代替，將砝碼用線相連并將線上標明長度，來控制打擊高度和重量。小鼠麻醉，剔除背部正中毛發，分離脊椎旁肌肉組織，暴露T9、T10和T11椎體，然后置于打擊模型下，對脊髓進行打擊，以損傷小鼠痙攣性擺尾及雙下肢及軀體回縮撲動為造模成功的標志。最后傷口消毒，縫合傷口，每天腹腔注射2 u青霉素。Sham組只進行前期手術操作，不對其脊髓進行打擊。

1.3.2 小鼠鞘內插管及給藥1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，頸后部剪毛、消毒，在兩耳連線中央做縱向切口，暴露枕骨寰枕膜，然而從此處插入PE-10管，插入約6～7 cm，最終達到蛛網膜下池，然后固定PE-10管。（SCI+ATL）組和（SCI+Vehicle）組在SCI手術后4和24h鞘內分別注射10μl ATL（300pmol）或等量Vehicle（0.9%NaCl）。5μl ALX siRNA（2g/L）或scramble siRNA于SCI手術前24 h鞘內注射。

1.3.3 行為學觀察SCI模型復制前及復制后1、2、3、4和5周對小鼠進行縮足閾值測定。主要采用von Frey細絲法，von Frey細絲（1.0～15 g）垂直刺激大鼠后足中央處，持續5～10 s，出現明顯縮足、舔足及抬足行為為陽性反應。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，qRT-PCR）通過RNA提取試劑盒提取不同組小鼠脊髓總RNA，然后進行逆轉錄反應，使用基因特異性引物進行qRT-PCR擴增，引物序列如表所示。通過軟件分析計算基因Ct，其中GAPDH作為內參；按照文獻方法計算相對基因表達=2-△Ct sample-△Ctcontrol[8]。見表1。

1.3.5 小膠質細胞培養1～2 d的新生FVB乳鼠處死后，取出腦組織，放入DMEM/F12培養基中剪碎，0.25%的胰酶消化消化，后離心5 min，用完全培養基培養細胞培養至第7～9天時可見膠質細胞分層，上層為小膠質細胞，然后分離純化小膠質細胞。采用不同濃度IFN-γ或ATL刺激小膠質細胞。

表1 相關基因引物序列

1.3.6 Western blot提取原代培養的小膠質細胞蛋白，取30 g進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），然后轉至聚偏氟乙?。╬olyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。經5%牛奶孵育1 h后，并用磷酸鹽緩沖液-T（phosphate buffered saline，PBS-T）洗膜3次，每次10 min。用兔抗P-p38 MAPK多克隆抗體（1∶2 000）和鼠抗β-actin多克隆抗體（1∶2 000）4℃孵育3 h，PBS-T洗3次，每次10 min。用PBS-T稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗（1∶25 000），室溫孵育1 h。PBS-T洗3次，每次5 min。利用化學發光掃描系統檢測相關蛋白表達并攝片，采用Quantity one圖像分析軟件對吸光度積值進行分析。

1.3.7 ELISA培養的小膠質細胞進行不同的處理后，對細胞進行裂解，通過ELISA試劑盒規定的步驟檢測不是處理后小膠質細胞腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）濃度。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均值比較用重復測量設計的方差分析，兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATL對小鼠SC I的鎮痛作用

小鼠SCI損傷后可導致兩側后腳持續的機械性痛覺增敏。與Sham小鼠比較，小鼠SCI后同側（2～5周）（F=12.42，P=0.004）和對側（1～5周）（F=13.83，P=0.003）后腳縮足反應閾值（paw with drawal threshold，PWT）降低，而鞘內注射ATL后可改善機械性痛覺增敏（見表2和圖1）。

表2 各組小鼠SC I后不同時間同側及對側后腳PW T比較（n=6，±s）

表2 各組小鼠SC I后不同時間同側及對側后腳PW T比較（n=6，±s）

組別1周2周3周4周5周同側組對側組S h a m S C I + V e h i c l e S C I + A T L S h a m S C I + V e h i c l e S C I + A T L1 . 5 1 ± 0 . 3 51 . 6 4 ± 0 . 3 7 1 . 2 4 ± 0 . 3 9 0 . 6 0 ± 0 . 0 0 0 . 5 6 ± 0 . 0 0 0 . 7 0 ± 0 . 1 8 0 . 8 0 ± 0 . 2 1 1 . 7 4 ± 0 . 4 0 1 . 2 0 ± 0 . 5 1 1 . 1 0 ± 0 . 6 0 1 . 3 2 ± 0 . 3 5 1 . 1 5 ± 0 . 2 01 . 6 0 ± 0 . 4 21 . 7 0 ± 0 . 5 31 . 5 8 ± 0 . 4 01 . 5 0 ± 0 . 3 81 . 8 5 ± 0 . 3 8 0 . 4 0 ± 0 . 0 0 0 . 3 8 ± 0 . 0 0 0 . 3 6 ± 0 . 0 0 0 . 4 0 ± 0 . 2 0 0 . 3 7 ± 0 . 1 0 0 . 9 6 ± 0 . 2 8 0 . 8 0 ± 0 . 2 0 0 . 8 3 ± 0 . 2 4 0 . 8 2 ± 0 . 2 3 0 . 8 0 ± 0 . 0 01 . 6 5 ± 0 . 3 71 . 7 6 ± 0 . 4 51 . 9 0 ± 0 . 4 0

圖1 ATL緩解小鼠SC I后機械痛覺增敏

2.2 ATL通過ALX受體對鎮痛作用的影響

與scramble siRNA比較，ALX siRNA降低SCI后7 d脊髓中ALX mRNA水平。鞘內注射ALX siRNA不改變小鼠SCI后7 d同側后腳的機械敏感性（F=2.745，P=0.159），但是降低小鼠SCI后7 d對側后腳的PWT（F=10.872，P=0.009），這與圖1中鞘內注射ATL在SCI后7 d的鎮痛作用一致。見圖2。

2.3 ATL對SC I誘導小膠質細胞標志物和促炎癥因子表達的影響

圖2 干擾ALX受體影響ATL的鎮痛作用

SCI小鼠鞘內注射ATL或Vehicle后，脊髓中ALX mRNA水平表達相似（見圖3A）。各組間IBA-1mRNA水平差異有統計學意義（F=14.737，P=0.002），與Sham小鼠比較，SCI小鼠IBA-1mRNA水平增高（P=0.009）；而鞘內注射ATL可降低IBA-1mRNA表達（P=0.013）（見圖3B）。但是ATL對星形膠質細胞標志物GFAP影響差異無統計學意義。同時各組間TNF-α mRNA水平差異有統計學意義（F=12.157，P=0.006），與Sham小鼠比較，SCI小鼠TNF-α mRNA水平增高（P= 0.006）；而鞘內注射ATL可降低TNF-α mRNA表達（P=0.007）（見圖3C）。

圖3 ATL降低SC I 7 d后小膠質細胞標志物和促炎癥因子表達

2.4 ATL抑制原代小膠質細胞TN F-α釋放

各組間P-p38MAPK表達差異有統計學意義（F=15.745，P=0.001），小膠質細胞受到IFN-γ刺激后，P-p38MAPK表達增加（P=0.032）；而ALT可降低P-p38MAPK表達（P=0.015）（見圖4A）。與此同時，不同組間TNF-α釋放差異有統計學意義（F=16.062，P=0.001），IFN-γ可誘導小膠質細胞釋放TNF-α（P=0.001）；而ALT可降低TNF-α釋放（P=0.003）（見圖4B）。

圖4 ATL抑制原代小膠質細胞激活

3 討論

SCI可引起炎癥和慢性疼痛。因而控制SCI誘導的炎癥反應可以改善神經損傷和神經病理性疼痛。然而，很少有藥物被證明能夠安全、有效治療神經炎癥和疼痛。本研究中，筆者評估ATL對小鼠SCI中神經炎癥和神經病理痛的影響。研究表明，ATL能有效抑制SCI后小膠質細胞激活及神經病理性疼痛。

目前對SCI引起的疼痛，主要采用抗驚厥藥和抗抑郁藥治療，但效果不佳，同時伴有嚴重的副作用[9]。本研究表明，SCI前鞘內注射ATL能夠緩解SCI引起的神經病理性疼痛。ATL是機體內產生的抗炎脂類介質，主要來源于脂肪酸代謝，在各種炎癥及神經病理性疼痛動物模型中具有較強的鎮痛效果[10]。ATL主要作用于G蛋白偶聯的ALX受體，但也可以結合其他受體，包括芳基烴受體、白三烯受體和CB1大麻素受體等[11]。本研究發現，通過特定siRNA干擾ALX受體ATL是機體內產生的抗炎脂類介質后可抑制ATL的鎮痛作用，表明ALX受體是ATL是機體內產生的抗炎脂類介質SCI動物中脂質介質的作用靶點。筆者的研究結果還表明，ATL也可減少SCI引起小膠質細胞激活及促炎癥細胞因子TNF-α釋放。而TNF-α在疼痛中發揮關鍵作用，所以ATL鎮痛作用可能與抗炎作用有關[12]。TNF-α也是一個關鍵促炎疼痛介質，因為它可以影響涉及疼痛傳導的多個機制。同時TNF-α也能減少對脊髓突觸傳遞的抑制，刺激釋放其他的促炎癥細胞因子，并誘導免疫和神經膠質細胞增殖，從而增強神經炎癥和疼痛傳導[13]。筆者也觀察到，ATL可降低SCI誘導小鼠脊髓小膠質細胞標記物IBA-1表達；同時也抑制原代小膠質細胞受到IFN-γ刺激后p38的磷酸化及TNF-α釋放。在出血動物模型中已經證實，外源性ATL可抑制小膠質細胞p38的磷酸化[14]。以往研究表明，脊髓中注射米諾環素，一種廣泛使用的小膠質細胞抑制劑，可抑制SCI后脊髓背角神經元和疼痛敏感性[15]，這與本研究中另一種小膠質細胞抑制劑ATL的作用是相似的。

總之，ATL可以改變小鼠SCI后脊髓小膠質細胞促炎癥反應，更重要的是，可以有效持久緩解機械性痛覺增敏。為下一步觀察ATL在SCI后神經炎癥和神經病理性疼痛中的作用打下基礎。

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Effect of ALT on neuropathic pain after spinal cord injury in mice

Yun-he Guo,Xiang Li,Wei-dong Mi
(Department of surgery,School of Medicine,Shanxi Datong University, Datong,Shanxi 037009,China)

ObjectiveTo evaluate the effects of aspirin-triggered lipoxin A4(ATL)on spinal neuroinflammation and neuropathic pain in mice model of spinal cord injury(SCI).MethodsModified Allen'hit model at T10was carried out in adult FVB mice.To test if ATL can reduce neuroinflammation and neuropathic pain, each mouse received two intrathecal injections of ATL(300 pmol)or vehicle at 4 and 24 h after SCI.Sensitivity to mechanical stimulation of the hind paws was evaluated by von Frey monofilaments,and the neuroinflammation was tested by measuring the mRNA expression levels of microglial markers and cytokines in the spinal cord samples after SCI.Also,microglia cultures prepared from mice cortical tissue were used to assess the direct effects of ATL on microglial activation and release of pro-inflammatory TNF-α.ResultsATL treatment caused significant reductions in the intensity of mechanical pain hypersensitivity and spinal expression levels of microglial markers and pro-inflammatory cytokines induced by SCI,when compared to the control group.Notably,the increased expressions of the microglial marker IBA-1 and pro-inflammatory cytokine TNF-α were affected by the ATL treatment mostly.ConclusionsOur results suggest that ATL can effectively modulate microglial activation and TNF-α release through ALX receptors,ultimately reduce neuropathic pain in mice after SCI.

aspirin-triggered lipoxin A4;spinal cord injury;neuropathic pain;mice

R441.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.006

1005-8982（2017）08-0027-05

2016-12-12