利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術（Xpert M TB/R I F）快速診斷淋巴結核及其耐藥性

孫海柏，張麗霞，秦中華，郭明日，張東，白虹

（1.天津市醫科大學基礎醫學院，天津300070；2.天津市海河醫院，天津300350）

利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術（Xpert M TB/R I F）快速診斷淋巴結核及其耐藥性

孫海柏1，張麗霞2，秦中華2，郭明日2，張東2，白虹1

（1.天津市醫科大學基礎醫學院，天津300070；2.天津市海河醫院，天津300350）

目的探討Xpert MTB/RIF試驗在診斷淋巴結核及其對利福平耐藥的意義。方法選取156例疑似膿腫性淋巴結核患者的膿液分別進行960液體變色培養基培養、涂片鏡檢、傳統比例法藥敏試驗以及Xpert MTB/RIF試驗檢測，分析Xpert MTB/RIF試驗檢測MTB及其耐藥性的敏感性和特異性。結果以液體變色培養基培養試驗作為金標準，Xpert MTB/RIF試驗檢測淋巴結核的敏感性和特異性分別為（95.42%，84.00%），Kappa值為0.77，兩者一致性較好。以傳統比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF試驗檢測利福平耐藥的敏感性和特異性分別為（70.0%，98.42%）兩種方法檢測結果比較差異無統計學意義。結論Xpert MTB/RIF試驗檢測淋巴結核及其耐藥性與傳統的檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，并且檢測時間短、及時的優點。

淋巴結核；利福平耐藥；敏感性；特異性；Xpert MTB/RIF

頸部淋巴結核是結核分枝桿菌侵入頸部淋巴結所致的一種淋巴結病變，按病程可分為結節型、浸潤型、膿腫型及潰瘍型[1]。以膿腫性淋巴結核最為常見，治療不及時或不理想結核桿菌還要破壞掉病變處大量組織甚至骨組織，留下功能障礙，所以尋找及時準確快速的實驗室診斷方法至關重要。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin,Xpert MTB/RIF）檢測痰標本中結核分枝桿菌與TB培養法有較高一致性[2]。本文利用目前快速檢測結核菌的方法Xpert MTB/RIF對患者的膿液直接進行檢測，并對其敏感性和特異性進行分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年8月-2016年10月于天津市海河醫院確診淋巴結核的住院患者156例：單純頸部淋巴結結核例58例，淋巴結結核合并肺結核89例，腋窩淋巴結結核合并肺結核2例，腹股溝淋巴結結核合并肺結核7例。納入標準：淺表淋巴結經B超檢查提示淋巴結有液化、壞死，或肉眼見膿腫和（或）竇道形成未進行過抗結核治療的首診患者；其中，男性41例，女性115例；年齡17～80歲。

1.2 儀器與試劑

PLR-線性探針雜交酶顯色法診斷試劑盒（Geno Type MTBDR pIus，德國Hain Life-science公司），Hotstar Taq酶（德國Qiagen公司），MGIT960液體培養基及藥敏管（美國BD公司）；Hain GT Blot-48全自動雜交儀（德國Hain Lifescience公司），聚合酶鏈式反應儀（Polymerase chain reaction，PCR）（德國Hain Lifescience公司），Eppen-dorf 5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），生物安全柜（山東省青島市海爾公司）。

1.3 試驗方法

BACTEC MGIT960液體培養及耐藥性檢測、痰抗酸染色均按照結核病診斷細菌學檢驗規程進行操作，線性探針法檢測淋巴結核及其對利福平耐藥性，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，配對計數資料χ2檢驗，行×列表資料χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，Kappa一致性系數，敏感性及特異性分析。

2 結果

2.1 患者M G I T960液體培養、Xpert M TB/R I F檢測以及抗酸染色淋巴結核膿標本情況

3種方法所需檢測時間分別為（4～8周、2h及2h），陽性率分別為（83.90%，82.80%和69.23%），χ2=12.39，P＜0.01以MGIT960液體培養為金標準，Xpert MTB/RIF檢測的敏感性與特異性分別為（95.42%和84.00%），Kappa值為0.77，一致性較好（見表1）。

表1156 例患者M G I T960培養檢測及Xpert M TB/R I F陰陽性比較例

2.2 Xpert M TB/R I F法等級與抗酸染色陽性等級

采用行×列表資料χ2檢驗，χ2=72.66，P＜0.01，故兩種檢測的方法等級比較差異有統計學意義，其中Xpert MTB/RIF“極低”級中5例抗酸染色為陰性的情況，Xpert MTB/RIF低組“低”級中6例抗酸染色為陰性的情況，Xpert MTB/RIF“中”級以及“高”級中未出現抗酸染色陰性的例數（見表2）。

表2156 例標本抗酸染色法陽性級別與Xpert M TB/R I F法檢測結果比較例

2.3 Xpert M TB/R I F技術與傳統比例法藥敏試驗耐藥性檢測結果

156例檢測標本以藥敏試驗檢測結果為金標準，采用Xpert MTB/RIF技術檢測156例菌株的RFP耐藥性，其中有19例標本在檢測中未檢測出來，137例標本檢測后敏感性、特異性分別為（70.00%和98.42%），檢測結果（χ2=0.50）（見表3）。

表3137 例菌株比例法藥敏試驗利福平耐藥性與Xpert M TB/R I F方法利福平耐藥性檢測比較例

2.4 Xpert M TB/R I F法對利福平耐藥基因突變位點檢測

分析線性探針法檢測為陽性的9例標本耐藥基因突變位點分析結構圖（見表4）。

表4 Xpert M TB/R I F耐藥基因突變位點分析及構成比

3 討論

本研究選取肺外結核中的淋巴結核病為例，用Xpert MTB/RIF與金標準的檢測方法MGIT960培養法、抗酸染色法進行比較分析，本實驗中抗酸染色的的陽性率僅為69.23%較低，傳統結核菌培養法雖然敏感性及特異性較高，結核分枝桿菌（結核桿菌）生長營養要求高，繁殖速度慢所以其檢測時間較長，需4～8周，不能及時為臨床提供治療依據，痰涂片對標本含菌量要求高，導致其診斷結核病的敏感性較低，在MTB培養陽性標本中敏感性僅為45%～48%[3-6]Xpert MTB/RIF利福平耐藥性遺傳學基礎是rpoB基因內81bp利福平耐藥決定區（RIF）的突變[7]。Xpert MTB/RIF技術是利用MTB耐藥性與基因突變有關的分子機制，以rpoB基因為靶基因，設計引物探針選擇性覆蓋rpoB基因利福平耐藥決定區81 bp核心區，以檢測標本是否含有結核分枝桿菌復合群以及利福平是否耐藥[8]。整個實驗僅需要2 h，儀器自動檢測是否為結核分枝桿菌復合群（MTB）及是否對利福平耐藥。因此，該方法適合于各種標本類型進行檢測，所以對肺外結核病的早期診斷及其耐藥性的檢測占很大優勢。

研究結果顯示，Xpert MTB/RIF與MGIT960培養法對于MTB的檢測率差異無統計學意義，MGIT 960培養和藥敏結果為參照，Xpert MTB/RIF診斷淋巴結核的敏感性與特異性分別為（95.42%和84.00%）較高Kappa值為0.77，一致性較好，Xpert MTB/RIF對利福平檢測的敏感性/特異性分別為70.00%和98.42%，Kappa值2.54。表明兩種方法對利福平耐藥性的檢測具有極好的一致性。與國內穆成等[9]報道的關于結核分支桿菌的檢測的敏感性90.6%稍微偏低，特異性98.7%相近。

本研究中Xpert MTB/RIF檢測中與痰抗酸染色比較分析有11例標本痰涂片為陰性而Xpert MTB/ RIF檢測為陽性可能與留取的標本中捕獲到的結核菌量較少有關系。Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性與MGIT960藥敏不一致的情況，可能是由于rpoB區內其他突變所致或者由于其他基因突變導致，理論上標本中含有一種以上的MTB混合培養或污染時，若其中一種具有突變探針未涵蓋的突變，將出現野生型帶型[10]，所以不能完全排除部分突變為無義突變的原因。

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R522

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.028

1005-8982（2017）08-0137-03

2016-11-01

白虹，E-mail：hongbai25@163.com