馬鈴薯懸浮細胞對溫度脅迫的生理響應機制

余斌 黃銳 南運有 孔娜娜 黨仁美 拜占玲 劉娟

摘要：選擇馬鈴薯品種大西洋和甘農薯5號的懸浮細胞為研究對象，通過分析其在5 ℃、20 ℃及40 ℃環境下的細胞相對生長量、質膜離子滲漏率、細胞活力值、滲透調節物質質量分數、光合系統ⅡFv/Fm來闡明馬鈴薯在溫度脅迫下的生理適應機制。結果表明，不同馬鈴薯品種對溫度脅迫的適應性不同，環境溫度為5 ℃時馬鈴薯懸浮細胞的生長狀態最好。

關鍵詞：馬鈴薯；懸浮細胞；溫度脅迫

中圖分類號：S532 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2017）07-0015-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.07.006

Abstract：The suspension cell of Atlantic and Gannong 5 cultivars are selected as the research object. Through the analysis in the 5 ℃ and 20 ℃ and 40 ℃ under the environment of relative cell growth， plasma membrane ion leakage rate， cell viability， osmolyte concentration， photosystem II Fv/Fm， To elucidate the physiological adaptation mechanism of potato under temperature stress. The result showed different potato cultivars had significantly different adjustment to temperature stress. The suspension cell of potato grew best when the temperature reached 5 ℃.

Key words：Potato；Suspension cell；Temperature stress

植物在生長發育過程中會受到各種不利的生物和非生物因子的影響，如高溫、低溫[1 - 2 ]、 干 旱[3 ]、高鹽[4 ]、病蟲侵害等。溫度作為一種重要的非生物因素，對植物的生長發育有重要影響。每種植物的生長發育都有特定的溫度需求。馬鈴薯是世界第四大栽培作物[5 ]，對溫度較為敏感，是一種喜冷涼怕熱的作物，其發育最適溫度是13～18 ℃。當溫度達到30 ℃左右時植株生長就會受到影響，呼吸作用旺盛，光合作用降低，同時蒸騰作用加強；當溫度低于-2～-1 ℃時，就會受凍，低于-4 ℃植株就會死亡。近年來世界氣候異常現象頻繁出現，極端氣候事件對農業經濟和生態環境造成極大危害[6 ]。我國農業設施環境簡陋，控溫能力不強，再加上近年來國際、國內碳排放量問題嚴重，加劇氣溫變化。溫度脅迫在今后很長一個時期內仍然會成為威脅我國農業生產的一個重要因素。據保守估計，我國馬鈴薯因高溫干旱及低溫霜凍災害年損失率高達25% 以上[7 ]。因此，研究并增強馬鈴薯自身對溫度脅迫的抵抗能力對穩定我國的糧食生產安全具有重要作用。

面對上述嚴峻的形勢，近年來在農業生產上，有關植物對逆境響應機制的研究在生命科學領域的位置越來越突出[8 ]，其中溫度脅迫對作物生長的研究也備受關注，而利用細胞學方法可以在不同生理條件和環境因素下，對細胞形態、生長速度、活力、功能及相互作用進行系統研究，從而為溫度脅迫下植物的細胞功能調控機制、植物響應脅迫的機理研究提供新的突破口。

馬鈴薯是怕霜凍、忌炎熱的溫度敏感型作物，研究馬鈴薯懸浮細胞在極溫逆境下的生理適應機制，對科學地解釋馬鈴薯對極端環境的適應機制有非常重要的意義，可為生產實踐中降低高、低溫脅迫對馬鈴薯的傷害而提高產量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大西洋（Atlantic）、甘農薯5號2個馬鈴薯品種的脫毒試管苗。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備馬鈴薯懸浮細胞 將大西洋、甘農薯5號2個馬鈴薯品種的脫毒試管苗葉片切口后，接在脫分化培養基（MS+2，4-D 2.5 mg/L+KT 0.8 mg/L+LH 0.7 g/L + 3%蔗糖，pH 5.8）上，28 d后將誘導出的愈傷組織轉至愈傷繼代培養基（MS+ 2，4-D 2.0 mg/L+ NAA 1.0 mg/L +YE 200 mg/L + 天門冬素100 mg/L + 3%蔗糖，pH 5.8）培養，每隔21 d繼代一次，共繼代3次，培養在20 ℃黑暗培養箱中進行。以繼代培養后的愈傷組織作為懸浮細胞培養的起始材料，用鑷子把愈傷組織夾碎后置于含20 mL液體培養基的l00 mL三角瓶內。組成液體培養基（MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+ CH 250 mg/L+3%蔗糖，pH 5.8）。三角瓶置于旋轉式搖床中。在120 r/min，20 ℃，黑暗下培養。每5 d繼代1次。

1.2.2 脅迫處理 懸浮細胞經過35 d的繼代懸浮培養后，分別放置在20 ℃、5 ℃和40 ℃培養箱（光周期為光照16 h、暗培養8 h，培養瓶表面光強50 mmoL/m2·s ）中，懸浮培養15 d后進行各項生理指標測定。

1.2.3 相對生長量測定 采用稱量法。懸浮細胞經過35 d的繼代懸浮培養后，接種到新培養基（稱重W1）上，稱重培養基與懸浮細胞總重（W1+2），進行脅迫處理（方法同上）15 d后，再次稱重處理后的培養基與懸浮細胞的總重（W′1+2），將處理后的懸浮細胞轉移到新的培養基，對處理后的培養基也進行稱重（W′）。相對生長量的計算公式為：（W′1+2- W′）-（W1+2 - W1）。

1.2.4 相對電導率的測定 相對電導率反映了離子滲漏情況，應用Rapacz [9 ]方法測定電導率。取處理后的懸浮細胞0.25 g，加5 mL去離子水，測定電導率（Ct）。為測定100%電解質泄漏率，最后一次測定后將測試管加蓋煮沸20 min，冷卻后測定殺死樣電導率（Ck）。相對電導率（RCt）按Tsarouhas[10 ] 的公式計算：RCt =（Ct / Ck）×100。

1.2.5 細胞TTC還原能力測定 根據Ishikawa[11 ]的TTC還原法測定。取處理后的懸浮細胞0.5 g置1小瓶，加3 mL的0.08%TTC溶液（用50 mmol/L，pH 7.5的磷酸鈉緩沖液配制），加蓋置黑暗靜置24 h后，吸去TTC溶液，收集樣品，用蒸餾水清洗3次。吸去水溶液，加3 mL 95%的乙醇上蓋，置60 ℃恒溫箱10 min。冷卻后搖勻，于酶標儀上測OD485，以處理前的樣品作為對照，以光密度值的大小表示細胞活力。

1.2.6 游離脯氨酸質量分數測定 采用酸性茚三酮法[12 ]。取處理后的懸浮細胞材料0.5 g用液氮研磨至粉末狀，加入3%磺基水楊酸研磨提取，離心（20 000 r，5 min），上清液加入冰醋酸和茚三酮試劑，沸水浴中加熱10 min。提取液中加入4 mL甲苯，混勻，靜置后取甲苯層，用紫外可見分光光度儀測定OD520。

1.2.7 光合系統ⅡFv/Fm的測定 將處理后的懸浮細胞置于暗處適應15 min以上，待細胞完全暗適應后用便攜式葉綠素熒光分析儀PAM2100進行測定。

2 結果與分析

2.1 溫度脅迫處理下馬鈴薯懸浮細胞相對生長量的變化

為測定5 ℃低溫脅迫及40 ℃高溫脅迫對馬鈴薯懸浮細胞生長的影響，將經過繼代培養的懸浮細胞，接種0.05 g進行脅迫處理15 d后，通過稱量法測定處理后的相對生長量。結果表明：5 ℃低溫環境下，2個馬鈴薯品種的懸浮細胞的生長量顯著高于20 ℃常溫與40 ℃高溫。20 ℃常溫與40 ℃高溫環境下的馬鈴薯懸浮細胞生長量無顯著差異。3個溫度條件下，2個馬鈴薯品種之間懸浮細胞生長量無顯著差異。表明5 ℃的低溫更加適合馬鈴薯懸浮細胞生長（圖1）。

2.2 溫度脅迫處理對馬鈴薯質膜離子滲漏率的影響

植物在遭受低溫或高溫脅迫時，質膜的結構被破損，導致細胞原生質內含物外滲、離子滲漏，并引發很多生理功能喪失。通過電導率法來測定所得的質膜離子滲透率已廣泛用于植物抗凍、抗熱性評價的生理指標。如圖2所示，2個品種的馬鈴薯懸浮細胞在20 ℃及40 ℃高溫環境下的質膜離子滲透率都高于5 ℃，且40 ℃環境下馬鈴薯懸浮細胞的質膜離子滲漏率顯著高于5 ℃、20 ℃，說明馬鈴薯細胞膜在高溫環境下傷害較為嚴重。大西洋（Atlantic）在40 ℃和20 ℃環境下質膜離子滲漏率均低于甘農薯5號，說明其在高溫脅迫下具有更好的適應性。

2.3 溫度脅迫處理對馬鈴薯懸浮細胞活力的影響

細胞活力即在細胞群體中活細胞占總細胞數的百分比。利用TTC還原法測定的細胞活力值，可直接表明細胞活力。如圖3所示，5 ℃下2個馬鈴薯懸浮細胞活力值均為最高；其次為20 ℃；在40 ℃高溫下2個馬鈴薯懸浮細胞活力值均處于較低水平，由此可見，在5 ℃低溫環境下馬鈴薯懸浮細胞活力最強，在40 ℃高溫時細胞膜的完整性受到破壞，細胞活力受到影響。大西洋（Atlantic）在5 ℃、20 ℃和40 ℃環境下懸浮細胞活力均高于甘農薯5號。

2.4 溫度脅迫處理下馬鈴薯懸浮細胞游離脯氨酸質量分數的變化

在正常條件下，植物游離脯氨酸含量很低，但遇干旱、低溫等逆境時，游離脯氨酸便會大量積累，主要是在逆境中對植物起到保護作用，因此脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標。通過檢測馬鈴薯懸浮細胞游離脯氨酸質量分數的變化發現（圖4），在5 ℃低溫處理下馬鈴薯懸浮細胞中的游離脯氨酸質量分數顯著高于20 ℃和40 ℃環境中的游離脯氨酸，40 ℃高溫處理與20 ℃的測定值基本相等。在20 ℃和40 ℃環境中，大西洋（Atlantic）和甘農薯5號的游離脯氨酸質量分數無顯著差別，在5℃環境下，大西洋（Atlantic）懸浮細胞中的游離脯氨酸質量分數顯著高于甘農薯5號，說明大西洋（Atlantic）較甘農薯5號在5 ℃環境下具有更強的低溫保護性。

2.5 溫度脅迫處理下馬鈴薯懸浮細胞光合系統ⅡFv/Fm值的變化

原初光能轉化率效（Fv/Fm）反映了光合系統Ⅱ的光能轉化效率，所以光合系統ⅡFv/Fm值的變化可用來表示細胞在逆境脅迫下的適應機制。從圖5可以看出，大西洋（Atlantic）和甘農薯5號在5℃低溫處理下的光合效能較20 ℃增高，但變化不顯著，而40℃高溫脅迫下光合效能顯著下降。說明低溫對光合系統Ⅱ影響較低，細胞能維持穩定的光合效率，對低溫有較強的適應性；而高溫脅迫破壞了光合系統Ⅱ，阻礙了光能轉化的進行。在不同溫度下大西洋（Atlantic）較甘農薯5號光合效率均高，說明大西洋（Atlantic）吸收光能的能力強。

3 結果與討論

本研究通過對馬鈴薯普通栽培品種大西洋和甘農薯5號的懸浮細胞在5 ℃、20 ℃及40 ℃條件下進行處理，分析其細胞的相對生長量、質膜離子滲漏率、細胞活力值。發現不同馬鈴薯品種對溫度脅迫的適應性不同，大西洋（Atlantic）懸浮細胞的相對生長量、細胞活力值均高于甘農薯5號，而質膜離子滲透率低于甘農薯5號。在不同溫度下，5 ℃條件下2個品種馬鈴薯的懸浮細胞相對生長量、細胞活力值均高于20 ℃及40 ℃，質膜離子滲透率低于20 ℃及40 ℃。5 ℃條件更適合馬鈴薯懸浮細胞的生長，40 ℃使得細胞結構發生變化并出現損傷現象，懸浮細胞生長受到影響。目前，對植物在溫度脅迫下的響應機制的研究探討多集中在形態學、生理生化以及分子生物學等方面。自發現植物的解剖結構與其耐鹽性密切相關，植物細胞具有與之相適應的超微結構以來，很長一段時間內細胞學研究植物抗逆方法大多以對細胞微觀結構的觀察為主，期間陸續出現不同逆境脅迫對小麥[13 ]、玉米[14 ]、大豆[15 ]、番茄[16 ]、煙 草[17 ]等多種植物葉肉細胞超微結構影響的研究，表明所有植物細胞在逆境情況下均會影響細胞的相對生長量、破壞膜結構導致大量的原生質內含物和離子外滲、細胞活力值降低。

在植物細胞對溫度脅迫的生理響應機制方面，王海燕等[18 ]發現低溫脅迫可使發菜懸浮細胞的光合作用受到傷害。本研究中，馬鈴薯懸浮細胞在5 ℃時光合作用比20 ℃及40 ℃條件下高，在5 ℃大細胞的適應能力更強，經過一段時間的低溫適應，細胞能維持穩定的光合效率。馬鈴薯品種大西洋（Atlantic）比甘農薯5號適應性更好。徐勝 等[19 ]發現，植物在高溫脅迫下，由于體內活性氧代謝失調和自由基的積累，滲透調節物質大量積累，植物的抗逆性增強。本研究中，在溫度脅迫時，不同品種馬鈴薯懸浮細胞的滲透調節物質游離脯氨酸質量分數都增高，大西洋（Atlantic）懸浮細胞在5 ℃時比甘農薯5號顯著增高，馬鈴薯懸浮細胞的調節物質的積累使其細胞能夠調控自身的物質，以避免溫度脅迫對其細胞結構和身體機能帶來嚴重的傷害。大西洋（Atlantic）懸浮細胞在5 ℃游離脯氨酸質量分數高，其對逆境的調控能力強，大大降低了脅迫所引起的傷害。

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（本文責編：陳 珩）