菌根真菌與櫻桃苗建立共生組織的培養基篩選

王慧娟 吳曰程 張忠蘭 楊守軍 潘仕梅

摘要：【目的】篩選適宜菌根真菌與櫻桃苗建立共生組織的培養基，為提高櫻桃組培苗移栽成活率提供參考依據?！痉椒ā吭谂囵B基為DE、1/2DE、1/4DE及1/8DE的櫻桃組培苗瓶中分別接種純化菌根真菌，接種30、40、50和60 d后分別測定櫻桃組培苗根系的侵染率、株高、葉片酶活性、根系分枝數及組培苗成活率，篩選出適宜菌根真菌與櫻桃組培苗建立共生組織的培養基?！窘Y果】培養基為DE和1/2DE的櫻桃組培苗在接種菌根真菌30和50 d后全部死亡，培養基為1/4DE和1/8DE的櫻桃組培苗在接種菌根真菌60 d后仍保持20.0%和70.0%的成活率。接種菌根真菌30 d后，培養基為1/4DE 和1/8DE櫻桃組培苗的根系侵染率、根系分枝數、株高及葉片過氧化物酶活性逐漸增加，在接種菌根真菌后60 d達最大值?！窘Y論】在組培苗培養過程中接種菌劑使其根系菌根化，實際上是組培苗、菌根真菌和培養基間復雜的相互反應結果。1/8DE可作為較適宜菌根真菌與櫻桃組培苗建立菌根共生組織的培養基。

關鍵詞： 櫻桃苗；菌根真菌；培養基；共生體系；生長發育

中圖分類號： S662.5 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）05-0844-05

Screening medium for symbioses establishment between mycorrhizal fungi and Prunus pseudocerasus seedlings

WANG Hui-juan， WU Yue-cheng， ZHANG Zhong-lan， YANG Shou-jun， PAN Shi-mei*

（Yantai Institute， China Agricultural University， Yantai， Shandong 264670， China）

Abstract：【Objective】Medium for symbioses establishment between mycorrhizal fungi and Prunus pseudocerasus seedlings was screened in order to provide reference for improving transplanting survival rate of tissue-cultured P. pseudocerasus seedlings. 【Method】Tissue-cultured P. pseudocerasus seedlings in media DE， 1/2DE， 1/4DE and 1/8DE were inoculated. Root infection rate，plant height，leaf enzyme activity，branch number of root and survival rate of tissue-cultured seedlings were determined after 30， 40， 50 and 60 d of inoculation. Culture medium suitable for symbiosis between mycorrhizal fungi and P. pseudocerasus seedlings was selected. 【Result】The seedlings in DE and 1/2DE media died 30 and 50 d after mycorrhizal fungi inoculation， seedlings in media 1/4DE and 1/8DE remained 20.0% and 70.0% survival rates respectively. Root infection rate，branch number of root，plant height and leaf peroxidase activity of P. pseudocerasus seedlings gradually increased in 1/4DE and 1/8DE media 30 d after treatment and reached the peaks 60 d after inoculation. 【Conclusion】Inoculation of fungi during seedling culture process can make the root mycorrhizal， which is the complicated reaction among tissue-cultured seedlings， mycorrhizal fungi and medium. 1/8DE culture medium is beneficial for symbioses establishment between P. pseudocerasus seedlings and mycorrhizal fungi.

Key words： cherry seedling； mycorrhizal fungi； medium； symbioses； development and growth

0 引言

【研究意義】組培快繁技術的發展促進了果樹育種工作的進程，也為長期保存果樹種質資源提供了新手段，但與大田條件下生產的苗木相比，組培苗因具有非功能性根系，葉片葉綠素含量和光合速率很低，沒有或僅有發育很差的表皮及氣孔，常導致在移栽馴化階段過量失水、長勢弱而死亡，成活率較低（劉文科和楊其長，2005；段元杰等，2016）。因此，選用適宜的培養基、提高組培苗在試管內階段和馴化階段的生理狀況及品質，對其適應環境變異能力、成活力及定植后的生長和產量至關重要。目前，生產上所用櫻桃苗木多為組培脫毒苗，新建櫻桃園苗木死亡率較高，除栽培管理措施不當等因素外，櫻桃苗木根系不發達、過短或少有須根均為導致苗木死亡的主要原因（侯東梅，2016；王德歡等，2016）。菌根真菌能促進寄主植物對礦質營養吸收、碳氮循環、水分吸收和提高光合速率，進而改善其生長發育、有效成分積累及抗逆性（程俐陶等，2009）。因此，在櫻桃苗組培過程中接種高效菌根真菌并避免或減少培養基污染現象發生，建立菌根真菌與櫻桃苗共生體系，盡早實現苗木菌根化，對提高櫻桃苗移栽成活率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Smith和Read（1997）研究認為，菌根真菌能與陸地上80%的植物形成良好的共生關系，植物為真菌的生長繁殖提供光合產物，真菌為寄主植物提供生長發育所需養分。菌根真菌在根系上成功定植后，能改變寄主植物根的構型，促進寄主根系多分枝，增加不定根數量和根系直徑，延長根系壽命，進一步促進根系對養分的吸收，同時能形成較龐大的菌絲網絡將植物根系輻射不到土壤中的養分吸收，通過菌絲傳遞給根系，提高土壤養分的有效性，避免缺素癥狀發生（Schellenbaum et al.，1991；Harrier and Watson，2004；張金蓮等，2015；伍榮冬等，2016）。金輝等（2009）研究發現，接種菌根真菌的鐵皮石斛苗長勢旺盛，莖粗壯呈紅紫色，產生新根多，根系發達。李景蕻和張麗華（2015）采用菌根技術與組培技術相結合，創建藥用蘭科植物組培苗與菌根真菌共生的培養體系，不僅為工廠化生產種苗提供重要借鑒方式，還為保護和利用野生蘭科藥用植物資源提供了一條新途徑。王曉國等（2016）研究認為，幾乎所有蘭科植物都與真菌共生，可將真菌應用于兜蘭種群恢復。【本研究切入點】目前，未見菌根真菌與櫻桃組培苗共生培養研究的報道?！緮M解決的關鍵問題】在培養基為DE、1/2DE、1/4DE和1/8DE的櫻桃組培苗瓶中接種菌根菌劑，分析菌根真菌對櫻桃苗生長發育的影響，為建立櫻桃組培苗與菌根真菌共生體系、提高櫻桃苗移栽成活率提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試植物及菌根菌劑 供試紅燈櫻桃（Prunus pseudocerasus）組培苗由中國農業大學煙臺研究院苗木組培中心提供。供試菌根菌劑為地表球囊霉（Glomus versiforme），含分離孢子15個/mL，由青島農業大學提供。

1. 1. 2 菌根真菌分離純化及共生培養基 參考賈東貝等（2011）的方法進行菌根真菌分離純化。DE培養基參照Dijke和Eck（1995）的方法配制，培養基配方：1.0 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L MgSO4，1.0 mmol/L K2SO4，0.4 mmol/L KH2PO4，100.0 μmol/L FeSO4，25.0 μmol/L H3BO3，33.0 μmol/L MnCl2，2.8 μmol/L ZnSO4， 1.0 μmol/L NaMoO4，140.0 μmol/L Na2-EDTA，1.0 g/L 酵母浸膏，9.0 g/L可溶性淀粉，8.0 g/L瓊脂，pH 6.0。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗設計 將純化菌劑分別接種至培養基為DE、1/2DE、1/4DE和1/8DE的櫻桃組培苗瓶中，每瓶接種2塊約0.5 cm2菌塊，每處理10瓶櫻桃組培苗，4次重復。每瓶含1棵長勢相近、根系發育良好的櫻桃苗，苗高約3.81 cm，根系分枝數平均為7.1條，其中根長0～0.50 cm的根系2.6條，0.51～1.00 cm的根系0.5條，1.01～1.50 cm的根系4.0條，≥1.51 cm的根系0條。接種后在無菌室中觀察記錄組培苗的生長狀況。

1. 2. 2 測定項目及方法 接種30 d后分別測定櫻桃組培苗根系的侵染率、株高、葉片酶活性、根系分枝數及組培苗成活率，此后每隔10 d測定1次，共測定4次。菌根真菌侵染率測定采用臺盼藍染色法（Koske and Gemma，1989），過氧化氫酶活性測定采用Barber法（Barber，1980），根系分枝數分4個等級，即分別計數長度分別為0～0.50、0.51～1.00、1.01～1.50和≥1.51 cm的根系數量。

1. 3 統計分析

試驗數據采用SAS 6.0進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 接種菌根真菌對櫻桃組培苗根系侵染率的影響

從圖1可看出， DE培養基中的櫻桃組培苗在接種菌根真菌30 d后全部死亡，櫻桃組培苗根系的侵染率為0；1/2DE培養基中的櫻桃組培苗在接種菌根真菌后30和40 d，根系侵染率分別為2.5%和4.8%，接種后50和60 d組培苗全部死亡，根系侵染率為0；1/4DE和1/8DE培養基中的櫻桃組培苗根系侵染率與接種時間呈正相關，在接種后30～60 d，根系侵染率分別由3.3%和7.8%升至17.4%和36.4%。方差分析結果表明，接種60 d后，1/8DE培養基中櫻桃組培苗的根系侵染率顯著高于DE、1/2DE和1/4DE培養基（P<0.05，下同）。說明1/8DE培養基利于菌根真菌繁殖，促進根系侵染率的提高。

2. 2 接種菌根真菌對櫻桃組培苗根系分枝數的影響

由表1可知，DE培養基中的櫻桃組培苗在接種菌根真菌30 d后全部死亡，各根系長度等級的根系分枝數均為0，顯著低于相應1/2DE、1/4DE和1/8DE培養基中櫻桃組培苗的根系分枝數，1/2DE、1/4DE和1/8DE培養基中櫻桃組培苗的根系分枝數間差異不顯著（P>0.05，下同）；接種菌根真菌40 d后，DE培養基中櫻桃組培苗各根系長度等級的根系分枝數均為0，1/4DE和1/8DE培養基中櫻桃組培苗各根系長度等級的根系分枝數差異不顯著（1.01～1.50 cm長度等級的根系分枝數除外），但均與DE培養基中根系分枝數存在顯著差異；接種菌根真菌50 d后，1/8DE培養基中0.51～1.50 cm長度等級櫻桃組培苗的根系分枝數顯著高于其他培養基處理組，接種菌根真菌60 d后4個長度等級櫻桃組培苗的根系分枝數間差異顯著。說明1/8DE培養基更有利于櫻桃組培苗根系與菌根真菌共生生長。

2. 3 接種菌根真菌對櫻桃組培苗株高的影響

由表2可知，培養基DE和1/2DE中的櫻桃組培苗在接種菌根真菌后30和50 d全部死亡，株高為0；培養基1/4DE和1/8DE中的櫻桃組培苗在接種菌根真菌后30～40 d，株高差異不顯著，但顯著高于培養基DE和1/2DE中櫻桃組培苗的株高；在接種菌根真菌后50～60 d，1/8DE培養基中櫻桃組培苗的株高分別比1/4DE培養基中櫻桃組培苗顯著提高10.4%和11.1%。說明1/8DE培養基利于菌根真菌與根系建立共生組織，促進櫻桃組培苗生長。

2. 4 接種菌根真菌對櫻桃組培苗葉片酶活性的影響

從圖2可看出，培養基DE、1/2DE、1/4DE和1/8DE中的櫻桃組培苗在接種菌根真菌30和60 d后其葉片過氧化物酶活性分別為0、0.4、0.9、1.0 μmol/μgFW和0、0、1.5、1.8 μmol/μgFW。其中，接種菌根真菌后培養基1/4DE和1/8DE中櫻桃組培苗葉片的過氧化物酶活性均顯著高于培養基DE和1/2DE中的櫻桃組培苗；培養基1/8DE中櫻桃組培苗葉片的過氧化物酶活性始終高于1/4DE培養基，但僅在接種菌根真菌60 d后存在顯著差異。說明1/8DE培養基較適宜櫻桃苗與菌根真菌共生，有利于提高櫻桃組培苗的抗性。

2. 5 接種菌根真菌對櫻桃組培苗成活率的影響

從表3可看出，接種菌根真菌后30～60 d，培養基DE中櫻桃組培苗的成活率均為0；接種后30 d，培養基1/2DE、1/4DE和1/8DE中櫻桃組培苗的成活率分別為10.0%、90.0%和100.0%；隨著接種時間的延長，櫻桃組培苗的成活率逐漸下降，至接種后50 d，培養基1/2DE、1/4DE和1/8DE中櫻桃組培苗的成活率分別降至0、40.0%和80.0%；至接種后60 d，培養基1/8DE中櫻桃組培苗的成活率仍高達70.0%，為1/4DE組培苗成活率（20.0%）的3.5倍。說明1/8DE培養基能為櫻桃組培苗生長提供有利環境，提高成活率。

3 討論

Harrier和Watson（2004）研究認為，不同菌根真菌分離體與不同植物品種間的容納性存在差異，植物品種接種菌根真菌時應選擇對菌根共生利益最優的菌根真菌分離體，本研究結果與其一致，選用培養基為DE和1/2DE的櫻桃組培苗接種菌根真菌，組培苗分別在接種30和50 d后全部死亡，可能是培養基DE和1/2DE的營養較豐富，真菌繁殖速率較高，培養基表面被菌絲完全遮蔽造成培養基中溶解氧減少導致根系逐漸腐爛的緣故，而選用培養基為1/4DE和1/8DE的櫻桃組培苗接種菌根真菌，接種后60 d成活率仍分別達20.0%和70.0%。

本研究結果表明，培養基為1/4DE和1/8DE的櫻桃組培苗接種菌根真菌后根系的分枝數和長度隨接種真菌時間的延長逐漸大于培養基DE和1/2DE，說明所選用的菌根真菌能與櫻桃組培苗根系形成良好的共生體系，為菌根真菌的功能發揮提供了前提條件，與Berta等（1993）研究獲得的菌根真菌在根系上侵染成功后能在時間、空間、數量及結構方面改變根系形態的結論相似，也與Hooker等（1995）對辣椒的研究結果一致。接種菌根真菌促進了櫻桃組培苗根系長度和分枝數增加，提高了菌根化櫻桃組培苗根系對養分的吸收能力，進而促進株高增加，與金輝等（2009）研究認為鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養可提高鐵皮石斛根系對養分的吸收能力、促進幼苗生長的結論一致。李海燕等（2003）研究發現，AM真菌侵染寄主根系能激發寄主的防御反應，提高其過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、β-1，3葡聚糖酶及幾丁質酶等與抗病性有關的酶系的活性，進而使寄主植物對病蟲害的再次進攻產生快速反應，提高抗病蟲能力，本研究結果與其相似，菌根真菌與櫻桃組培苗共生培養后，菌根化櫻桃組培苗葉片的過氧化物酶活性明顯高于無菌根櫻桃組培苗，成活率顯著升高。

在組培苗培養過程中接種菌劑使其根系菌根化，實際上是組培苗、菌根真菌和培養基間復雜的相互反應結果。因此，所選用的培養基應適當降低其營養元素含量（但能保證組培苗對養分的最低需求），以避免或抑制真菌過快繁殖，本研究中，1/8DE能為櫻桃組培苗與菌根真菌形成共生體系提供較理想的場所，促進櫻桃組培苗生長發育。

4 結論

在組培苗培養過程中接種菌劑使其根系菌根化，實際上是組培苗、菌根真菌和培養基間復雜的相互反應結果。1/8DE可作為較適宜菌根真菌與櫻桃組培苗建立菌根共生組織的培養基。

參考文獻：

程俐陶，劉作易，郭巧生. 2009. 藥用植物叢枝菌根研究進展[J]. 中草藥，40（1）：156-160. [Cheng L T，Liu Z Y，Guo Q S. 2009. Advances in research on the mycorrhizal fungi of medicinal plants[J]. Chinese Medicinal Herb，40（1）：156-160.]

段元杰，劉海剛，孟富宣，楊玉皎，周軍. 2016. 棗樹花藥組織培養研究進展[J]. 江西農業學報，28（11）：47-50. [Duan Y J，Liu H G，Meng F X，Yang Y J，Zhou J. 2016. Research progress in tissue culture of Chinese jujube anther[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，28（11）：47-50.]

侯東梅. 2016. 新植大櫻桃死亡率高的原因及對策[J]. 山西果樹，（1）：28-29. [Hou D M. 2016. Reason and countermeasure of high mortality of new planted cherry[J]. Shanxi Fruits，（1）：28-29.]

賈東貝，楊濤，肇瑩，馬曉穎，李冰宇. 2011. 2株越橘菌根培養條件的研究[J]. 江蘇農業科學，39（2）：466-468. [Jia D B，Yang T，Zhao Y，Ma X Y，Li B Y. 2011. Research of two cowberry mycorrhizal culture[J]. Jiangsu Agriculture Science，39（2）：466-468.]

金輝，許忠祥，陳金花，韓素芬，葛頌，羅毅波. 2009. 鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養過程中的相互作用[J]. 植物生態學報，33（3）：433-441. [Jin H，Xu Z X，Chen J H，Han S F，Ge S，Luo Y B. 2009. Interaction between tissue-cultured seedlings of dendrobium officinale and mycorrhizal fungus during symbiotic culture[J]. Journal of Plant Ecology，33（3）：433-441.]

李海燕，劉潤進，李艷杰，束懷瑞，李玉. 2003. AM真菌和胞囊線蟲對大豆根內酶活性的影響[J]. 菌物系統，22（4）：613-619. [Li H Y，Liu R J，Li Y J，Shu H R，Li Y. 2003. Influence of mycorrhizal fungi Heterodera glycines on enzyme activity on soybean root[J]. Mycosystema，22（4）：613-619.]

李景蕻，張麗華. 2015. 藥用蘭科植物組培苗菌根化技術在種苗生產中的應用[J]. 應用技術，（8）：133-134. [Li J H，Zhang L H. 2015. Application of tissue culture and mycorrhizal technology of medicinal orchid plants for seedling production[J]. Application Technology，（8）：133-134.]

劉文科，楊其長. 2005. 菌根生物技術在植物組培苗生產中的應用[J]. 農業工程技術：溫室園藝，（9）：44-45. [Liu W K，Yang Q Z. 2005. Application of mycorrhizal biotechnology in the production of plant tissue culture seedlings[J]. Agriculture Engineering Technology：Greenhouse Horticulture，（9）：44-45.]

王德歡，施先鋒，張娜，葛米紅，李愛成，周謨兵. 2016. 紅掌組織培養育苗技術的研究進展[J]. 貴州農業科學，44（10）：107-110. [Wang D H，Shi X F，Zhang N，Ge M H，Li A C，Zhou M B. 2016. Research progress in tissue culture seedling-raising technique of Anthurium andraeanum[J]. Guizhou Agricultural Sciences，44（10）：107-110.]

王曉國，盧家仕，周主貴，李秀玲，陳廷速，卜朝陽. 2016. 帶葉兜蘭菌根真菌分離和初步鑒定[J]. 西南農業學報，29（2）：316-320. [Wang X G，Lu J S，Zhou Z G，Li X L，Chen T S，Bu C Y. 2016. Isolation and preliminary identification of mycorrhizal fungi from Paphiopedilum hirsutissimun（Orchidaceae）[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，29（2）：316-320.]

伍榮冬，韋金凡，龍艷艷，雷崇華，譚裕模，李廷化，陳廷速. 2016. 叢枝菌根真菌對宿根蔗生長的影響[J]. 西南農業學報，29（11）：2648-2652. [Wu R D，Wei J F，Long Y Y，Lei C H，Tan Y M，Li T H，Chen T S. 2016. Effect of inoculation of arbuscular mycorrhizal fungi on ratoon sugarcane grown in field[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，29（11）：2648-2652.]

張金蓮，黃振瑞，車江旅，譚裕模，王維贊，李冬萍，龍艷艷，盧文祥，李松，陳廷速. 2015. AM菌劑對大田甘蔗根際土壤AM真菌種群影響[J]. 西南農業學報，28（1）：269-273. [Zhang J L，Huang Z R，Che J L，Tan Y M，Wang W Z，Li D P，Long Y Y，Lu W X，Li S，Chen T S. 2015. Effcet of arbuscular mycorrhizal（AM） inoculum application on sugar-

cane rhizosphere AM fungi communities[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（1）：269-273.]

Barber J M. 1980. Catalase and peroxidase in primary leaves during development and senescence[J]. Zeitschrift für Pf-

lanzenphysiologie，97（2）：135-144.

Berta G，Fusconi A，Trotta A. 1993. VA mycorrhizal infection and the morphology and function of root system[J]. Environmental & Experimental Botany，33（1）：159-173.

Dijke E，Eck N D. 1995. Effects of mycorrhizal fungi on in vitro nitrogen response of some Dutch indigenous orchid species[J]. Canada Journal of Botany，73（8）：1203-1211.

Harrier L A，Watson C A. 2004. The potential role of arbuscular mycorrhizal fungi in the bioprotection of plants against soil-borne pathogens in organic and/or other sustainable farming systems[J]. Pest Management Science，60（2）：149-157.

Hooker J E，Black K E，Pery R L，Atkinson D. 1995. Arbuscular mycorrhizal induced alteration to root longevity of poplar[J]. Plant Soil，172（2）：327-329.

Koske R E，Gemma J N. 1989. A modified procedure for staining roots to detect VA mycorrhizae[J]. Mycological Research，92（4）：486-505.

Schellenbaum L，Tisserant B，Berta G，Ravolanirina F，Gianinazzi S，Fitter A H. 1991. Influence of endomycorrhizal infection on root morphology in a micropropagated woody plant species[J]. Annals Botony，68（2）：135-141.

Smith S E，Read D J. 1997. Mycorrhizal Symbiosis[M]. New York：Academic Press.

（責任編輯 思利華）