上海沿海地區蛭弧菌分離及其生長條件研究

程俊茗 尹清干 賈丹 袁海蘭 董龍香 胡鯤 楊先樂

摘要：【目的】了解上海沿海地區蛭弧菌的分布狀況及其生物學特性，為蛭弧菌在防治水產動物病害方面的應用提供參考依據。【方法】采用雙層瓊脂平板法對采自上海沿海地區不同水域環境中的蛭弧菌進行分離，利用16S rRNA進行鑒定，并對其裂解譜、鹽度耐受性、弧菌裂解差異性和培養方式進行研究。【結果】從上海沿海地區共分離到12株蛭弧菌，其中3株（4.2、5.1和3N.3）對弧菌屬具有很強的裂解性，但對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、脫氮副球菌、乳酸鏈球菌和保加利亞乳桿菌等有益菌無裂解作用。3株蛭弧菌在鹽度1.5%～3.0%的范圍內生長狀況良好，5.1蛭弧菌株對溶藻弧菌的裂解能力較對副溶血弧菌和哈維氏弧菌的強，其差異達顯著水平（P<0.05）。宿主菌滅活可有效提高蛭弧菌的生長速度及其濃度，在培養第60 h達峰值；蛭弧菌與宿主菌（大腸桿菌）經異步發酵后，蛭弧菌在培養第72 h達峰值。【結論】從上海沿海地區分離獲得的蛭弧菌具有良好噬菌能力，對主要的海水致病菌和淡水致病菌均具有侵染裂解能力，對有益菌無殺滅效果，且具有廣鹽性特征，可用于蛭弧菌微生態制劑的研發。

關鍵詞： 蛭弧菌；鑒定；裂解譜；鹽度耐受性；裂解差異性；上海

中圖分類號： S963.211 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）03-0532-08

0 引言

【研究意義】蛭弧菌（Bdellovibrio）是一類以捕食細菌為生的革蘭氏陰性細菌，廣泛分布于淡水、污水、沉淀物、土壤和植物根際（Jurkevitch et al.，2000），因其可裂解大多數革蘭氏陰性細菌和少數革蘭氏陽性細菌，對水體中的致病菌具有裂解作用，為水產動物細菌病的生物防治提供了新途徑（Fry and staples，1976；宋志萍等，2005）。此外，蛭弧菌基因組可編碼多種有毒物質的抗阻蛋白，預示其有可能成為新型抗生素或消毒劑（蔡俊鵬和趙俊，2006）。蛭弧菌作為一種可裂解水體中致病菌的微生態制劑，能有效減少水產養殖動物細菌病的發病率，降低藥物殘留和細菌耐藥性風險，最終促進水產養殖業的持續健康發展。【前人研究進展】蛭弧菌對致病菌的裂解作用使其具有巨大的潛在應用前景。黃冬菊等（2002）研究表明，蛭弧菌對海水弧菌具有良好的清除作用； Pineiro等（2004）對蛭弧菌的宿主范圍進行研究，證實蛭弧菌對沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、變形桿菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬、弧菌屬中的眾多菌株具有很強的裂解能力；韓韞等（2005）通過研究蛭弧菌對弧菌的裂解效果，發現聯合使用4株蛭弧菌的裂解率高達93.8%；張呂平等（2009）研究表明，運用噬菌蛭弧菌能有效預防對蝦的弧菌病；儲衛華等（2009）研究發現，蛭弧菌能清除副溶血弧菌，降低因副溶血弧菌感染引起的對蝦死亡率，即蛭弧菌對對蝦感染副溶血弧菌有明顯的預防效果；黃亮等（2010）研究表明，蛭弧菌對牡蠣養殖水體和腸道中的副溶血弧菌具有清除作用；林阿乞等（2011）研究表明，將蛭弧菌應用到九孔鮑養殖中，其生長指標和存活率均有顯著提高；Cao等（2012， 2015）研究發現蛭弧菌能夠控制霍亂弧菌和氣單胞菌；李麗等（2013）研究表明，純化的蛭弧菌不僅能夠裂解大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、弧菌等革蘭氏陰性菌，還能夠裂解無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌。【本研究切入點】雖然國內市場上已有生產和銷售蛭弧菌制劑，但據溫崇慶等（2009）對蛭弧菌制劑的檢測結果顯示，絕大多數產品根本不存在蛭弧菌。本課題組曾采用PCR和傳統的平板法對26個蛭弧菌產品進行蛭弧菌分離，也均未分離到蛭弧菌。因此，有必要進一步探討環境因素（鹽度、宿主和發酵方式）對蛭弧菌生長的影響，為提高蛭弧菌制劑的性能提供參考。【擬解決的關鍵問題】采用雙層瓊脂平板法對上海沿海地區不同水域環境中的蛭弧菌進行分離，探究其裂解譜、鹽度耐受性及弧菌裂解差異性，并采用液體培養法研究不同培養方式對蛭弧菌增菌效果的影響，優化其培養條件，以期為蛭弧菌在水產動物病害防治方面的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

宿主菌株共24株，分別為大腸桿菌21（Escherichia coli）、大腸桿菌AB90054、哈維氏弧菌V-1-3120（Vibrio harveyi）、哈維氏弧菌B0150、霍亂弧菌B0165（V. cho-

lerae）、溶藻弧菌1833（V. alginolyticus）、副溶血弧菌0394（V. parahemolyticus）、鰻弧菌Van-DC12R90387（V. anguillarum）、熒光假單胞菌ATCC10646（Pseudomonas fluorescens）、腐敗假單胞菌0397（P. putrefaciens）、溫和氣單胞菌0398（Aeromonas sobria）、溫和氣單胞菌AB、嗜水氣單胞菌1.927（A. hydrophila）、嗜水氣單胞菌Sc-96-24、嗜水氣單胞菌Ah9802120388、金黃色葡萄球菌B0125（Staphylococcus aureus）、乳酸鏈球菌X13（Streptococcus lactis）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、納豆芽孢桿菌（B. natto）、脫氮副球菌ATCC-

19367（Paracoccus denitrificans）、釀酒酵母20034（Saccharomyces cerevisiae），均由國家水生動物病原庫保存提供。細菌全基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，營養肉湯、瓊脂購自國藥集團化學試劑有限公司。主要儀器設備：掃描電子顯微鏡（S3400N II）、PCR儀（GT9612）、培養箱（MIR253）、離心機（CF16R）和恒溫搖床[BSD-YX（F）3200]。

1. 2 樣品采集

分別采集上海金山城市沙灘沿海（采樣點1）的海水40 mL及表層底泥20 g、上海崇明島富民農場沿海（采樣點2）的海水40 mL及表層底泥20 g、上海蘆潮港沿海（采樣點3）的海水40 mL和上海炮臺濕地公園沿海（采樣點4）的海水40 mL及表層底泥20 g，樣品采集后冷藏（0～6 ℃）運回實驗室。將水樣和底泥（以無菌海水稀釋）放入50 mL的離心管中，2000 r/min離心15 min，取上清液，4 ℃保存備用。采樣站位分布如圖1所示。

1. 3 蛭弧菌分離純化與鑒定

采用雙層瓊脂平板培養法對處理過的水樣和泥樣進行蛭弧菌分離，根據出斑時間及噬菌斑形狀純化蛭弧菌，采用錢天樂等（2009）的方法對蛭弧菌進行電鏡觀察前處理；參照Marchesi等（1998）和Jurkevitch等（2000）的方法設計特異性引物，再以通用引物（5'-

CAGGCCTAACACATGCAACTC-3'）為上游引物、特異引物Bdg842R（5'-CGWCACTGAAGGGGTCAA-3'）

為下游引物進行PCR擴增。PCR反應體系50.000 μL，其中，10×PCR Buffer（含1.5 mmol/L Mg2+）7.500 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.400 μL，Taq酶（2 U/μL）0.625 μL，上、下游引物各2.000 μL，DNA模板（10 ng/μL）5.000 μL，用DEPC處理水補足至50.000 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行32個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，產物送至上海邁浦生物科技有限公司測序，測序結果在GenBank中進行BLAST分析，并構建系統發育進化樹。

1. 4 蛭弧菌裂解譜分析

選取24株宿主菌株，采用雙層瓊脂平板培養法對3株蛭弧菌進行裂解譜分析。雙層瓊脂平板培養基下層為1.2%瓊脂（20 mL）、上層為0.8%瓊脂（10 mL），上層培養基加入3×1011 CFU/mL宿主菌懸液1 mL。宿主菌懸液的制備：用營養肉湯培養宿主菌株24 h，然后4500 r/min離心15 min，用0.85%生理鹽水洗滌菌體沉淀3次，最后將菌懸液濃度調至3×1011 CFU/mL，4 ℃冷藏備用。

1. 5 蛭弧菌鹽度耐受性分析

采用雙層瓊脂平板培養法，將蛭弧菌置于不同鹽度（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%）下培養，根據形成噬菌斑數量判斷蛭弧菌對鹽度的耐受性，并測定最佳生長鹽度。

1. 6 蛭弧菌裂解差異性分析

選用不同宿主菌（溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌和大腸桿菌）對蛭弧菌株進行平板計數，以大腸桿菌為參照，根據形成的噬菌斑數量判斷蛭弧菌對宿主菌侵染裂解作用。噬菌斑形成數量越多，表明蛭弧菌對某一宿主的侵染裂解效率越強。

1. 7 培養方法對蛭弧菌生長的影響

1. 7. 1 宿主菌滅活對蛭弧菌發酵的影響 宿主菌滅活培養法：制備好的大腸桿菌懸液90 ℃水浴滅活30 mim，滅活后的大腸桿菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至3×108 CFU/mL。將蛭弧菌以5%的接種量接入大腸桿菌懸液中，28 ℃下搖床（140 r/min）培養，每隔12 h對蛭弧菌的生長情況進行觀察記錄，直至96 h結束。宿主菌不滅活培養法：將新鮮的大腸桿菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至3×108 CFU/mL，除不進行滅活處理外，其他處理同宿主菌滅活培養法。

1. 7. 2 發酵方式對蛭弧菌生長的影響 營養肉湯同步發酵培養法：將大腸桿菌菌液和蛭弧菌液均以5%的接種量同時接入無菌營養肉湯，28 ℃下搖床（140 r/min）培養。營養肉湯異步發酵培養法：將大腸桿菌先接入營養肉湯培養至3×108 CFU/mL后，再以5%的接種量將蛭弧菌液接入大腸桿菌懸液中，28 ℃下搖床（140 r/min）培養。

2 結果與分析

2. 1 蛭弧菌的分離鑒定結果

從4個采樣點的水樣和泥樣中共分離獲得12株分離菌株，分別命名為5.1、4.2、3N.3、L5.3、C7.2、Y4.1、X1.1、Y4.5、L6.1、8.5、8.1和6.3。經PCR擴增其16S rRNA序列，結果發現12株分離菌株均在800 bp附近出現清晰的單一條帶（圖2），與預期結果相符。測序結果在GenBank中進行BLAST分析并構建系統發育進化樹（圖3），結果顯示，12株蛭弧菌均與Bdellovibrio聚為一支。因此證實12株分離菌株均為蛭弧菌。

蛭弧菌在雙層瓊脂培養基上形成的噬菌斑具有多樣性（圖4），與大腸桿菌共培養60 h后可觀察到清晰的噬菌斑。不同蛭弧菌形成的噬菌斑略有不同，主要表現為凹陷程度和透明斑大小，如5.1蛭弧菌株的噬菌斑形態為深入凹陷且透明，4.2蛭弧菌株的噬菌斑形態透明但不凹陷，8.1蛭弧菌株的噬菌斑非常小、透明、不凹陷。經掃描電鏡觀察發現，蛭弧菌呈圓桿狀，具有端生單根鞭毛，菌體大小0.65 μm×0.30 μm，鞭毛長2.00 μm（圖5）。

2. 2 分離蛭弧菌的裂解譜

從12株蛭弧菌中選取3株（4.2、5.1和3N.3）進行裂解試驗，結果表明，3株蛭弧菌對所有宿主弧菌（哈維氏弧菌V-1-3120、哈維氏弧菌B0150、霍亂弧菌B0165、溶藻弧菌1833、副溶血弧菌0394和鰻弧菌Van-DC12R90387）均具有良好的裂解能力，但對枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、脫氮副球菌、乳酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌等有益菌沒有裂解作用（表1）。其中，5.1蛭弧菌株對致病菌具有良好的裂解能力，除了能裂解弧菌外，對嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和腐敗假單胞菌也有裂解作用，是一株裂解譜較廣的優良蛭弧菌株。

2. 3 蛭弧菌鹽度耐受性分析結果

由圖6可看出，3株蛭弧菌在鹽度1.5%～3.0%的范圍內生長狀況良好。其中，5.1蛭弧菌株對鹽度的耐受范圍是0.5%～4.0%，最適生長鹽度2.5%；4.2蛭弧菌株對低鹽度具有較好的耐受性，最適生長鹽度1.5%；3N.3蛭弧菌株具有較強的耐鹽能力，在鹽度為4.5%時依然能生長，是一株廣鹽性菌株。

2. 4 蛭弧菌裂解差異性分析結果

以5.1蛭弧菌株為代表，分析溶藻弧菌1833、副溶血弧菌0394、哈維氏弧菌V-1-3120和大腸桿菌AB90054等宿主菌對蛭弧菌生長的影響，結果（圖7）表明，5.1蛭弧菌株在以溶藻弧菌1833為宿主菌的雙層瓊脂培養基上能夠形成大量噬菌斑，與副溶血弧菌0394、哈維氏弧菌V-1-3120和大腸桿菌AB90054相比，存在顯著差異（P<0.05），表明5.1蛭弧菌株對溶藻弧菌的侵染效果強于副溶血弧菌、哈維氏弧菌和大腸桿菌。

2. 5 培養方法對蛭弧菌增菌效果的影響

由圖8可看出，宿主菌（大腸桿菌）經滅活后，蛭弧菌在培養第60 h達峰值，相對于其他3種方法，營養肉湯滅活宿主菌法達峰值時間最短。宿主菌未經滅活處理而直接與蛭弧菌同步發酵培養，蛭弧菌達峰時間延遲，但濃度并未快速下降。其原因可能是將宿主菌滅活后其細胞壁結構遭到破壞，減少蛭弧菌進入宿主菌的阻力，達到快速進入宿主的目的，導致蛭弧菌快速增殖；到培養后期，其他3個處理組的宿主菌形態結構和活力變化不明顯，而滅活處理組中由于未被侵染的宿主菌發生自溶，失去原有結構，致使蛭弧菌下降最迅速。

3 討論

弧菌病在魚、蝦、蟹及貝類等水產動物中發病率高，是一類危害最嚴重的細菌性疾病，給水產養殖業造成巨大經濟損失（李亞晨等，2004；楊少麗等，2005）。本研究從上海沿海地區分離獲得12株蛭弧菌，有3株（4.2、5.1和3N.3）對5種弧菌具有良好的裂解能力，且表現為對溶藻弧菌的裂解能力較對副溶血弧菌和哈維氏弧菌的強，但對芽孢桿菌、脫氮副球菌、乳酸菌等有益菌無裂解作用。其中，5.1蛭弧菌株對致病菌具有良好的裂解能力，除了能裂解5種弧菌外，對嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌和腐敗假單胞菌也具有裂解作用，是一株裂解譜較廣的優良蛭弧菌株。Taylor等（1974）研究表明，從海水分離獲得的蛭弧菌對大多數海洋細菌及陸生細菌均有裂解能力，但對少數陸生菌株的裂解效率較低。Takubo等（1989）研究認為，裂解差異可能與宿主表面結構及蛭弧菌的識別系統差異有關。此外，蛭弧菌鹽度耐受性分析結果表明，5.1蛭弧菌株（分離自上海蘆潮港水樣）具有廣鹽性特征，可能是采樣點受海水與淡水相互作用而導致菌株的廣鹽性；3N.3蛭弧菌株分離自上海炮臺濕地公園的水樣，因采樣點地處海水侵蝕區域導致其對鹽度耐受性較強；4.2蛭弧菌株對鹽度的耐受性不及上述的2株蛭弧菌株。可見，蛭弧菌能夠適應鹽度變化，且對大多數致病菌具有裂解作用，能達到凈化水質、消除致病菌和防治細菌性疾病等多重目的。

為優化蛭弧菌的培養條件，本研究采用液體培養法探討不同培養方式對蛭弧菌增菌效果的影響，結果發現宿主菌（大腸桿菌）滅活處理后，蛭弧菌在培養第60 h達峰值，相對于其他3種方法，該方法的達峰時間最短；宿主菌不滅活組的蛭弧菌在培養第72 h達峰值，相對于宿主菌滅活組的達峰時間延遲，且蛭弧菌濃度相對較低。Shemesh和Jurkevitch（2004）研究認為，蛭弧菌裂解大多數革蘭氏陰性宿主細菌后，殘余的宿主細胞對蛭弧菌具有耐受性。即滅活宿主菌失去對蛭弧菌的耐受性，有助于蛭弧菌生長，使得蛭弧菌滴度提高且峰濃度提前；而未滅活宿主菌對蛭弧菌的侵染產生耐受性，阻礙其生長。此外，在同步發酵和異步發酵中，殘余的大腸桿菌對蛭弧菌可能會產生耐受性。Varon和Zeigler（1978）曾研究認為，蛭弧菌和宿主菌的比例需達1∶250時蛭弧菌才可以捕食；Frataminco和Whiting（1995）報道宿主菌與蛭弧菌比例為10∶1是蛭弧菌裂解宿主的最佳條件。本研究的同步發酵處理在遲緩期（培養第12 h）呈下降趨勢，可能是初始接種的宿主菌量未達上述比例要求，無法供蛭弧菌正常生長而導致其死亡。

一般情況下，蛭弧菌生長較緩慢，至少需要培養48 h才能形成肉眼可見的噬菌斑，且許多蛭弧菌屬于非可培養細菌（李祎等，2013）。隨著分子生物技術的快速發展，快速檢測蛭弧菌的方法不斷優化，但針對其活體的檢測只有平板培養法。康穎倩等（2014）、溫崇慶等（2015）分別采用16S rRNA基因擴增和構建克隆文庫對水體中的蛭弧菌進行檢測，結果分離出高度多樣的蛭弧菌；薛明等（2014）研究發現，在分離計數海洋蛭弧菌及其多樣性檢測時采用海水培養基的效果優于聚蛋白胨培養基。目前，只有極少數的近海海洋微生物能通過傳統固體培養基培養獲得菌落，而絕大多數能在顯微鏡下觀察到的環境微生物都不能在傳統固體培養基上形成可見菌落（Eilers et al.，2000；Rappe and Giovannoni，2003）。可見，蛭弧菌的培養獲得仍是其優勢種篩選及研究的瓶頸。加之蛭弧菌在保存過程中極易死亡，即使綜合運用甘油和液氮進行嘗試（田雙娥和蔡俊鵬，2014）也未能獲得良好的效果，因此今后需要進一步優化蛭弧菌的培養及保藏方法。

4 結論

從上海沿海地區分離獲得的蛭弧菌具有良好噬菌能力，對主要的海水致病菌和淡水致病菌均具有侵染裂解能力，對有益菌無殺滅效果，且具有廣鹽性特征，可用于蛭弧菌微生態制劑的研發。

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（責任編輯 蘭宗寶）