飛機草鏈格孢毒素的培養條件、分離及活性測定

李雨龍　張宇　楊葉　趙磊　符旖晴

摘要：【目的】對鏈格孢菌株LGB100401的產毒培養條件及毒素的除草活性進行評估，為飛機草的生物防治提供理論依據。【方法】以從海南田間染病的飛機草上分離到的鏈格孢菌LGB100401菌株為材料，采用以生物測定為導向的乙酸乙酯萃取和硅膠柱層析等方法對LGB100401菌株所產毒素進行分離純化及產毒條件研究，并采用離體葉片針刺接種法測定38種植物對LGB100401菌株所產毒素的敏感性?！窘Y果】LGB100401菌株可產生毒素并導致飛機草葉片枯死，最適產毒條件為25 ℃、pH 4～6、光暗交替培養15 d。LGB100401菌株分泌的毒素對供試38植物具有選擇毒性，其中，供試雜草對鏈格孢粗毒素不敏感（NS）的有17種、稍敏感（LS）4種、敏感（MS）7種、極敏感（SS） 4種，表現為極敏感的雜草為飛機草、馬唐、羽芒菊和賽葵；供試的6種作物中只有水稻表現為敏感（MS），其他5種作物不敏感或表現輕微癥狀?！窘Y論】飛機草鏈格孢毒素對飛機草具有較高的抑制活性，具有較高的生防潛力。

關鍵詞： 飛機草；鏈格孢毒素；產毒條件；分離純化；除草活性

中圖分類號： S451；S476 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0087-05

Abstract：【Objective】The research evaluated toxin production cultural conditions for Alternaria alternata strain LGB100401 and herbicidal activity of the toxin， in order to provide theoretical basis for biological control of Chromolaena odorata. 【Method】A. alternata strain LGB100401 isolated from infected C. odorata in field in Hainan was taken as material. The bioassay-guided ethyl acetate extract and silica gel column chromatographic separation were used to isolate， purify the toxin and research the toxin production conditions. Sensitivity of 38 species of plants to the toxin was tested using detached leaf puncture inoculation method. 【Result】Results showed that LGB100401 could produce toxins which led to necrosis of C. odorata leaf. The optimal cultural conditions for producing toxin were temperature 25 °C， pH 4-6， cultured period 15 d under alternation of light and dark. The toxin had selective toxicity towards the 38 species of plants. Sixteen species were not sensitive（NS） to the toxin， four species were slightly sensitive（LS）， eight species were sensitive（MS） and four species were very sensitive（SS）. The four species which were very sensitive were C. odorata， Digitaria sanguinalis， Tridax procumbent and Malvastrum coromandelianum. Among the six tested crops， only rice was sensitive（MS） to the toxin， the rest five crops were not sensitive or only showed slight symptom. 【Conclusion】Alternaria alternata toxin from C. odorata has strong inhibitory effect on C. odorata. It may be useful for biological control of C. odorata.

Key words： Chromolaena odorata； Alternaria alternata toxin； toxin production condition； separation and purification； herbicidal activity

0 引言

【研究意義】飛機草[Chromolaena odorata （L.） King & Robinson]是國家環境保護總局和中國科學院聯合公布的我國首批16種外來入侵物種之一，在海南省廣泛分布，對當地的農林牧業、物種多樣性和生態系統安全造成了嚴重危害。由于飛機草生長繁衍快且具有灌木的特性，化學防除和機械防除效果有限。利用天然活性化合物研發新一代除草劑是當前除草劑研究熱點之一（程亮和郭青云，2015）。眾多研究表明，與直接利用病原真菌作為生物除草劑相比，微生物代謝產物提供了更廣闊的生物除草前景。目前，真菌毒素作為一種環保型農藥被廣泛研究，植物病菌所產生的毒素也是獲得除草活性化合物及研究開發新型除草劑的重要來源?！厩叭搜芯窟M展】在真菌產生的毒素中，鏈格孢屬（Alternaria）產生的毒素備受關注，其中，交鏈格孢[A. alternata（Fr.） Keissler]是一類分布廣泛的真菌，其寄主植物超過380種（Mirhosseini et al.，2015）。研究表明，來源于不同罹病植物的鏈格孢可產生多種毒素成分，對多種雜草具有除草活性（Ghorbani et al.，2000；Mohan Babu et al.，2003；Ostry，2008），是已知病原菌中產生毒素最多的種類。從紫莖澤蘭上分離獲得的鏈格孢能產生有致病作用的毒素，并從其代謝產物中分離到細交鏈格孢菌酮酸（簡稱TeA毒素），該毒素主要通過抑制紫莖澤蘭葉片光系統II的電子傳遞從而對其產生毒害作用（Chen et al.，2005；Qiang et al.，2006）。此外，鏈格孢產生的鏈格孢菌毒素（AAC毒素）具有廣譜和快速除草活性，其效果與百草枯相似（Qiang et al.，2010）；引起番茄莖枯病的鏈格孢菌產生的AAL毒素對龍葵、曼陀羅具有抑制活性（Abbas et al.，1995）。不同來源菌株所產生的毒素存在明顯差異，植物病原菌在寄主體外產生的毒素還與其培養條件密切相關，不同培養條件下其毒素活性大小、分泌物質種類、含量多少等均不盡相同（萬佐璽等，2001；Varej o et al.，2013）。【本研究切入點】目前，國內利用本土植物病原真菌所產生毒素防除飛機草的研究尚無報道。【擬解決的關鍵問題】利用從海南田間染病的飛機草上分離到的1株高毒力鏈格孢菌，采用硅膠柱層析等方法分離毒素，并采用離體葉片法對其產毒適宜條件及粗毒素的殺草活性進行測定，旨在為飛機草的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

鏈格孢菌株LGB100401（GenBank登錄號KT2095-

89）從海南省自然發病的飛機草葉片上分離獲得。包括飛機草在內的38種植物材料（其中雜草32種、作物6種，表1）用于生物測定，植物材料從海南大學環境與植物保護學院教學基地及?？诮紖^采集。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 粗毒素制備 選用PSK培養液（30 g蔗糖、1 g K2HPO4、1000 mL蒸餾水）進行液體培養。將菌株LGB100401于PDA培養基上培養7 d后，取菌塊（直徑=5 mm）轉接到200 mL的PSK培養液中（500 mL三角瓶），每瓶5個菌塊，低轉速（90 r/min，6 h/d）振蕩與靜置結合培養，分別置于不同條件（不同培養時間、不同培養溫度、不同pH的培養液和不同光照）下培養。采用真空抽濾法使菌絲與培養液完全分離，獲得無菌含毒濾液。將含毒濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，40 ℃旋轉蒸發濃縮獲得粗毒素。將純化的粗毒素用無菌水稀釋為1 mg/mL的待測液。

1. 2. 2 LGB100401毒素生物活性測定 采用離體葉片針刺接種法測定毒素對飛機草葉片的生物活性。取離體健康的飛機草葉片用自來水沖洗，用1.5%次氯酸鈉溶液表面消毒1 min，再用無菌水沖洗并晾干，用無菌解剖針針刺葉片造成輕微傷口（只刺破下表皮）。將10 μL待測液滴到葉片刺傷處，葉片置于含有濕濾紙的培養皿中，28 ℃保濕培養3 d后用十字交叉法測量病斑直徑。以無菌水為對照，根據病斑直徑比較毒素產量及活性。每處理3次重復。

1. 2. 3 LGB100401最佳產毒條件篩選

1. 2. 3. 1 不同培養時間對LGB100401產毒的影響 將接種有菌塊的培養液于28 ℃下培養，培養時間分別為5、10、15、20、25和30 d，按1.2.1的方法制備含毒濾液及純化毒素，通過生物測定確定最佳培養時間。

1. 2. 3. 2 不同培養溫度對LGB100401產毒的影響 將接種有菌塊的培養液分別置于15、20、25、30和35 ℃培養15 d后取樣，按1.2.1方法制備含毒濾液及純化毒素，通過生物測定確定最佳培養溫度。

1. 2. 3. 3 不同pH的培養液對LGB100401產毒的影響 用10% NaOH和10% HCl分別將培養基的pH調節至3、4、5、6、7、8、9和10，分別接入菌塊，置于25 ℃培養15 d后取樣，按1.2.1方法制備含毒濾液及純化毒素，通過生物測定確定培養液最佳pH。

1. 2. 3. 4 不同光照處理對LGB100401產毒的影響 將接種菌塊的培養液分別于24 h光照、24 h黑暗、12 h光照/12 h黑暗3種條件下25 ℃培養15 d后取樣，按1.2.1方法制備含毒濾液及純化毒素，通過生物測定確定最佳光照條件。

1. 2. 4 毒素的柱層析分離 在500 mL具存儲球四氟乙烯層析柱中，控制大孔吸附樹脂（DA201型）與無菌培養濾液樣量比例為1∶10，流速為2 mL/min；將無菌濾液上柱后用90%乙醇洗脫至流出液無色，收集洗脫液，常溫下減壓濃縮為浸膏，大量獲得粗毒素。

100～200目硅膠于110 ℃下烘干2 h后放干燥器中備用。將毒素粗品與硅膠拌樣（毒素∶硅膠=1∶2），在60 ℃水浴濃縮成粉末樣品。采用干法裝柱并上樣，取40 g處理好的樣品緩慢、均勻撒向層析柱，最后在樣品表面緩慢傾倒一層石英砂。先用3～4 L的石油醚淋洗柱子，使柱內硅膠均勻覆蓋以徹底清除氣泡，同時沖走油狀雜質。再按極性由弱到強的順序用不同的溶劑進行梯度洗脫，分別收集。取10 μL洗脫液，采用離體葉片針刺接種的方法檢測LGB100401毒素對飛機草的生物活性，將有活性組分的洗脫液根據洗脫系統和極性進行合并，并再次檢測其活性。洗脫系統：A、B、C分別按石油醚∶乙酸乙酯=5∶1、5∶3、1∶1混合，D為乙酸乙酯單劑，E、F分別按乙酸乙酯∶甲醇=5∶2、1∶1混合，G為甲醇單劑。

1. 2. 5 植物敏感性測試 選取健康、長勢良好的供測38種植物成熟葉片，以1 mg/mL毒素溶液按1.2.2的方法接種，于28 ℃培養7 d后，檢查病斑，并以病斑直徑作為植物敏感性指標。敏感性分級（谷祖敏等，2009）：NS為無病斑，不敏感；LS為刺傷點有輕微的侵染，病斑直徑≤2 mm，輕度敏感；MS為刺傷點有侵染并有擴展，病斑直徑3～6 mm，敏感；SS為嚴重侵染，病斑直徑>6 mm，極敏感。

1. 3 統計分析

試驗數據采用SPSS 19.0進行單因子分析，利用Tukeys test進行均數間差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 培養條件對LGB100401菌株產毒的影響

液體培養初期，隨著培養時間的延長，LGB100401菌株的菌絲快速增長，產毒能力逐漸增強（圖1-A）。培養至15 d時，菌絲生長濃密，培養液變色明顯；生物活性測定結果表明，此時粗毒素導致的病斑直徑最大，與第5、10、25和30 d的病斑直徑存在顯著差異（P<0.05，下同），說明此時菌株的產毒量最多。培養時間超過15 d后，病斑直徑逐漸減小，表明隨著培養時間延長菌株產毒量逐漸減少，毒素致病力緩慢下降。

培養溫度對菌株產毒有較大影響（圖1-B），培養溫度為25 ℃時毒素導致的病斑直徑最大，與其他溫度處理存在顯著差異，說明最適宜LGB100401產毒的溫度為25 ℃。

培養液pH在5～8時毒素的活性最強，4個處理的病斑直徑差異不顯著（P>0.05），表明培養液pH在5～8時有助于LGB100401菌株產毒（圖1-C）。

光暗交替培養下LGB100401菌株產生毒素活性最強，以全光照處理最差，兩處理間存在顯著差異（圖1-D）。

2. 2 柱層析結果

LGB100401菌株洗脫劑系統每500 mL收集1次，洗脫系統A～G分別收集12、11、10、10、10、11和6瓶洗脫組分。以離體葉片針刺法對每一瓶組分進行生物活性檢測，發現主要活性集中在洗脫系統B的第5～7瓶組分、洗脫系統C的第3～4瓶組分、洗脫系統E的第2～8瓶組分、洗脫系統F的第1～5瓶組分，分別將上述洗脫液合并后接種飛機草，3 d后洗脫系統B、C、E、F洗脫液均能使飛機草離體葉片產生明顯病斑，其中以E系統（乙酸乙酯∶甲醇=5∶2）洗脫液處理產生的病斑最大，對飛機草的抑制效果最佳（圖2）。因此，E洗脫系統為最佳洗脫劑，采用硅膠柱層析梯度洗脫法可大量分離純化鏈格孢毒素。

2. 3 毒素的殺草譜和作物安全性評價結果

室內離體葉片接種法測定結果（表1）表明，LGB100401菌株分泌的毒素對供試植物具有選擇毒性，1 mg/mL毒素溶液可引起寄主植物和部分非寄主植物葉片萎蔫和壞死。接種毒素后3 d，32種供試雜草中對鏈格孢粗毒素不敏感（NS）的有17種，占53.125%；稍敏感（LS）4種，占12.500%；敏感（MS）7種，占21.875%；極敏感（SS）4種，占12.500%，分別為飛機草、馬唐、羽芒菊和賽葵。供試的6種作物中只有水稻表現為MS，占16.667%，其他5種作物不敏感或表現輕微癥狀。表現較突出的是菊科植物，有4種表現為極敏感（SS）或敏感（MS）。測定結果表明，除飛機草外，LGB100401毒素對其他3種田間重要雜草馬唐、羽芒菊和賽葵也有較高的除草活性，具有潛在生物除草劑效能。

3 討論

據報道，一般真菌粗毒素含有脂類、糖類、蛋白類、雜環等大量物質，每種物質極性不一，彼此間極可能存在拮抗或增效等作用，且不同植物對其組分敏感性不同；而粗毒素的有效成分一般由多種組分協同作用對植物造成傷害（Ostry，2008）。本研究發現，鏈格孢菌株LGB100401產生的毒素對飛機草具有較高的除草活性，對海南省常見的雜草羽芒菊、馬唐和賽葵也具有很強的毒性，且該粗毒素對大多數供試植物毒性低，表現出較高的選擇性，具有潛在的生防價值。

本研究結果表明，鏈格孢菌株LGB100401產毒的最佳條件是25 ℃、pH 4～6、培養時間15 d及光暗交替培養，在培養15 d后毒素的產生量達峰值后隨著時間延長漸漸減少。在不同培養條件下鏈格孢產毒能力顯著不同，說明營養及培養條件直接影響植物病菌的產毒及產生毒素的量，與前人的研究結論（Zonno et al.，2008；郭霞等，2009）一致。粗毒素經過極性適宜的有機溶劑萃取和濃縮，可濾過除去大部分雜質，同時其中包含的多種活性組分得以充分提取和富集，從而發生協同作用，使得對飛機草的活性增強。采用大孔樹脂對粗毒素進行大量富集，再用硅膠柱層析梯度洗脫方法適用于鏈格孢毒素分離純化，與周兵等（2007）的研究結果一致。

本研究結果表明， LGB100401菌株具有開發為飛機草生物除草劑的潛力。該菌株潛在的應用價值及安全性等深入研究及更詳細的信息有待今后進一步探討。本研究結果有助于了解飛機草鏈格孢分泌的毒素對雜草的生物控制作用，為今后鏈格孢毒素的鑒定、開發，以及飛機草的生物防治打下基礎。

4 結論

飛機草鏈格孢菌株LGB100401可產生大量毒素，該毒素對飛機草具有較高的抑制活性，且對植物具有選擇作用特性。LGB100401菌株可作為飛機草生物防治的候選物加以研究。

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（責任編輯 麻小燕）