荷花腐敗病生防菌的篩選及鑒定

曾莉莎　莊華才　胡規媛　呂順　莫秀文　杜彩嫻　梁少麗　鄭芝波　周建坤　王芳

摘要：【目的】篩選對荷花腐敗病菌有較強拮抗作用的生防菌，為荷花的健康生產及荷花腐敗病的有效控制提供參考。【方法】采用抑菌圈法和對峙培養法從106株供試拮抗細菌中篩選對荷花腐敗病菌有較強拮抗作用的生防菌，經形態學、生理生化和分子鑒定確定生防菌分類地位，通過與其他6種作物病原真菌的對峙培養了解生防菌的抑菌譜，并通過田間小區試驗明確生防菌的田間防治效果。【結果】從供試的106株測試菌株中篩選獲得4株對荷花腐敗病菌具有拮抗效果的生防菌，其中以DR1菌株的拮抗效果最佳，抑菌帶寬為9.8 mm。DR1菌株的拮抗譜較寬，對供試6種植物病原真菌均具有良好的抑制活性。田間防效試驗結果表明， DR1菌株對荷花腐敗病的平均防效為41.83%。根據16S rDNA和gyrB基因序列分析結果并其結合生理生化特征，將DR1菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。【結論】解淀粉芽孢桿菌的拮抗活性、耐熱性和抗逆性強，且有較寬的抗菌譜，在荷花病害防治中具有較好的開發應用前景。

關鍵詞： 荷花腐敗病；生物防治；解淀粉芽孢桿菌；鑒定

中圖分類號： S476 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0092-08

Abstract：【Objective】The present study screened and identified the biocontrol bacteria against Fusarium commune， in order to provide reference for healthy planting of lotus and effective control of lotus rhizome rot disease. 【Method】Inhibition zone method and confrontation culture were employed to screen the biocontrol bacteria which had strong antagonism against F. commune out of 106 tested antagonistic bacteria. The biocontrol bacteria were identified according to morphology， physiology， biochemistry and molecular identification. Through confrontation culture with six phytopathogenic fungi， antimicrobial spectrum of the biocontrol bacteria was studied. Field control effects of biocontrol bacterium were explored through field experiment. 【Result】Four biocontrol bacteria with antagonism against lotus rhizome rot disease were selected out of 106 tested strains. Antagonist effects of strain DR1 was the best. Its bacteriostasis band width was 9.8 mm. Strain DR1 enjoyed wide antimicrobial spectrum， and showed inhibitory effects towards six tested phytopathogenic fungi. The field experiment results showed that average control effect of strain DR1 was 41.83%. Strain DR1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens for its biochemical characteristics based on 16S rDNA and gyrB gene sequence analysis. 【Conclusion】B. amyloliquefaciens has strong antagonism effect， heat resistance， strong stress resistance， and broad antimicrobial spectrum. Therefore， it possesses promising developing and applying prospect in lotus disease control.

Key words： lotus rhizome rot disease； biological control； Bacillus amyloliquefaciens； identification

0 引言

【研究意義】荷花是我國十大名花中唯一的水生花卉，在我國的濕地及觀光農業旅游等區域廣泛栽培。荷花全身都是寶，蓮子、蓮藕、蓮心、荷葉等均可食用或藥用，是人們喜愛的美食和養身佳品。荷花在生長發育過程中常受到荷花腐敗病（藕瘟）、小菌核葉腐病、葉疫病、褐斑病、葉片炭疽病和花葉病等10余種病害的危害（張寶棣等，1996；陳金安等，2006；何曉嬋等，2013；匡晶等，2015），其中腐敗病是荷花種植區發生最普遍且為害嚴重的病害之一（胡長志等，2013），在荷花生長期和蓮藕貯藏期均可發病，全國各荷花產區均有發生。荷花腐敗病屬土傳病害，病菌常造成藕鞭、藕節、藕根腐爛，同時地上部分的葉、花也會萎蔫黃枯，發病嚴重的整株枯死（梁志懷等，2010）。荷花腐敗病發生普遍，危害巨大，已成為制約荷花產業發展的重大障礙，也是我國發展都市農業過程中面臨的重要瓶頸問題。在荷花腐敗病防治中，由于荷花葉片的特殊結構（葉上表層有蠟質），一般農藥噴施不易被吸收，加之荷花是水生植物，施藥難度較大，導致化學防控對荷花腐敗病效果甚微。生物防治以其環境友好、安全等特性成為當前植物病害防治研究的熱點。因此，篩選對荷花腐敗病具有較好防治效果的生防菌，對荷花產業的健康發展具有重要意義。【前人研究進展】近年來，國內很多學者對蓮（荷花）腐敗病的病原菌、發生規律和化學防治進行了研究，并篩選出多種化學藥劑。陳傳聰等（2008）選用凱潤等殺菌劑對蓮腐敗病進行田間防效試驗，結果表明，25%凱潤乳油、30%愛苗乳油、25%丙環唑乳油和50%苯菌靈可濕性粉劑對蓮腐敗病均有較好的防治效果。梁志懷等（2010）對湖南省不同地區蓮腐敗病菌的致病性及遺傳差異性進行研究，結果表明，不同蓮腐敗病鐮孢菌間致病力存在一定差異。曾璐（2013）研究了化學藥劑和4種生防菌劑對蓮腐敗病的防病效果，結果表明，生防菌X23對湘蓮有明顯的增產作用，但由于后續田間調查未發現湘蓮腐敗病為害，因此未進行發病率及病情指數記錄。周小軍等（2015）對蓮藕腐敗病菌的生物學特性進行研究，結果表明，蓮藕腐敗病菌對溫度、pH、光照等適應范圍廣，最適溫度為28 ℃，最佳pH為7。【本研究切入點】目前關于荷花腐敗病生物防治及生防菌篩選的研究報道較少。【擬解決的關鍵問題】從土壤微生物中篩選能有效控制荷花腐敗病的生防菌株，并利用生物學特性和分子生物學手段對生防菌進行鑒定，為開發荷花腐敗病生防菌制劑提供菌種資源，也為荷花的健康生產及該病害的有效控制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試致病菌株 荷花腐敗病菌（Fusarium commune）Hhgw-2-4（曾莉莎等，2016）由東莞市香蕉蔬菜研究所從東莞橋頭鎮蓮湖公園發病荷花地下莖分離獲得，并經致病力測定確定為荷花腐敗病病原菌。蓮小菌核葉腐病菌（Sclerotium hydrophilum）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、甘蔗梢腐病菌（Fusarium sacchari）、火龍果潰瘍病菌（Neoscytalidium dimidiatum）和辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）均由東莞市香蕉蔬菜研究所保存。

1. 1. 2 拮抗菌來源 2013～2015年，先后對采自廣東省東莞市6個鎮的46份不同作物根際土壤樣品進行分離，其中香大蕉根際土壤樣品16份、蔬菜根際土壤樣品8份、甘蔗根際土壤樣品8份、荷花根際土壤樣品14份。從不同作物的根際土壤中共分離到拮抗細菌106株，其中分離自菜地15株、分離自甘蔗地35株、分離自香大蕉地32株、分離自荷塘土壤24株。所分離菌株保存于東莞市香蕉蔬菜研究所微生物實驗室。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 生防菌篩選

1. 2. 1. 1 生防菌初篩 采用抑菌圈法篩選生防菌。將荷花腐敗病菌Hhgw-2-4制成1×106 CFU/mL的孢子懸浮液，用移液器吸取30 μL均勻涂布在PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養基上，在培養基四周（距離中心2.5 cm處）放置4個直徑0.6 cm的圓濾紙片，吸取10 μL待測試生防菌菌懸液滴在濾紙上，以加入等量無菌水的PDA培養基為對照，每個測試菌株3次重復。28 ℃培養5 d后，測量不同測試菌株的抑菌圈大小，篩選出抑菌效果較好的生防菌。

1. 2. 1. 2 生防菌復篩 采用室內平板對峙法對初篩抑菌效果較好的生防菌進行復篩。從培養4 d的荷花腐敗病菌菌落邊緣取直徑為6 mm的菌餅，將菌餅移至空白的PDA培養基中央，在其四邊2.5 cm處等距離接入經初篩獲得的細菌，設不接種拮抗菌的培養基為對照，每個測試菌株3次重復。28 ℃培養7 d后，觀察不同測試菌株對荷花腐敗病菌的抑制效果，計算平均抑菌帶寬度，選取抑菌帶最寬的拮抗細菌作為荷花腐敗病生防菌。

1. 2. 2 形態學鑒定 對篩選獲得的生防菌，采用平板劃線法對其進行分離純化，觀察記錄菌落形態；根據革蘭氏染色結果確定該細菌的細胞壁類型（程麗娟等，2000；東秀珠和蔡妙英，2001）。

1. 2. 3 生理生化鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）對篩選獲得的生防菌進行最適生長溫度、pH、營養源、代謝特征等生理生化鑒定。

1. 2. 4 抑菌譜測定 選用平板對峙培養法進行抑菌譜測定（李建嫄等，2013）。將供試靶標致病菌菌餅（d=6 mm）置于PDA培養基中央，在其四周等距離（2.5 cm）處接入篩選獲得的生防細菌，以不接任何細菌的培養基為對照，每處理3次重復。28 ℃恒溫培養7 d后，觀察生防菌對蓮小菌核葉腐病菌、番茄灰霉病菌等不同植物致病菌的抑制情況，測量并計算平均抑菌帶寬度，用SPSS 19.0進行數據統計分析。

1. 2. 5 分子鑒定 利用16S rDNA和DNA解旋酶B亞基編碼基因（gyrB）對篩選獲得的菌株進行鑒定，16S rDNA序列和gyrB基因擴增引物和方法參照喻國輝等（2010）的描述。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離得到目的條帶。目的片段經DNA膠回收試劑盒回收純化后克隆到pMD18-T載體（TaKaRa）上，陽性克隆由賽默飛生命科學有限公司（Thermo Fisher）測序。獲得的基因序列在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上應用BLASTn軟件進行DNA序列相似性分析，從GenBank數據庫中下載相近模式菌株的gyrB和16S rDNA序列，利用MEGA 5.0軟件Neighbour-joining法構建系統發育進化樹。

1. 2. 6 田間防效試驗 選用1塊荷花腐敗病重病田作為試驗區（連續3年荷花腐敗病發病率在50.00%以上），試驗點位于廣東省東莞市橋頭鎮。種藕移栽前先用篩選獲得的生防菌1000倍發酵液浸泡試驗區土壤3 d，覆水深度2 cm，同時用稀釋500倍的生防菌發酵液對種藕進行浸泡處理，浸泡12 h后撈出播種。播種后從荷花出現浮葉開始施用生防菌，以后根據天氣情況每隔10～15 d用稀釋800倍的生防菌液噴施葉面1次，共施用3次，以不使用任何藥劑的處理為空白對照，每處理3次重復，每重復小區面積約0.07 ha，不同小區間用田埂隔開（如圖5-A所示）。在對照處理荷花出現萎蔫后開始調查，每隔10 d調查1次病葉率，至荷花腐敗病病情不再發展為止，共調查4次。按發病率和防效計算田間試驗結果。

發病率（%）=（病葉數/調查的總葉片數）×100

防效（%）=（對照發病率-處理發病率）/對照發病率×100

1. 3 統計分析

試驗數據利用SPSS 19.0進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 生防菌的篩選

采用抑菌圈法從106株供試拮抗細菌中初步篩選出4株對荷花腐敗病菌具有明顯拮抗作用的菌株，進一步復篩，得到分離自甘蔗根際土壤的菌株DR1的拮抗作用最強，對荷花腐敗病菌的抑菌帶為9.8 mm（圖1-A）。選取DR1菌株進行后續試驗。

2. 2 拮抗細菌DR1的抑菌譜測定

對峙培養結果表明，拮抗細菌DR1對供試蓮小菌核葉腐病菌、香蕉枯萎病菌、番茄灰霉病菌、甘蔗梢腐病菌、火龍果潰瘍病菌和辣椒疫病菌均表現出較強的抑制作用（圖1），其中，對蓮小菌核葉腐病菌的抑制作用最強，其抑菌帶寬與其他植物病原菌抑菌帶寬差異顯著（P<0.05，下同），其次為火龍果潰瘍病菌和香蕉枯萎病菌（表1），表明DR1菌株是一株廣譜拮抗細菌。

2. 3 生防菌株DR1的種類鑒定

2. 3. 1 菌落形態 DR1菌株在LB培養基上培養24 h后形成的單菌落類似圓形，邊緣不規則，有隆起，表面褶皺，不透明，干燥，菌落呈淺黃色；液體培養靜止時有菌膜形成。顯微鏡下觀察，菌體桿狀，周生鞭毛，形成芽孢，芽孢卵圓形，卵囊膨大（圖2）。

2. 3. 2 生理生化特性 DR1菌株的生理生化特性表現：革蘭氏染色呈陽性，菌株接觸酶、厭氧生長、硝酸鹽還原、酪朊水解、明膠水解、淀粉水解、檸檬酸鹽利用和V-P反應呈陽性，酪氨酸水解和苯丙氨酸脫氨酶為陰性，可利用D-葡萄糖、甘露醇、L-阿拉伯糖及D-木糖作為碳源（表2）。觀察發現，DR1菌株在pH 5.7條件下能生長；在5% NaCI下不生長；在50 ℃下不生長（表2）。參照東秀珠和蔡妙英（2001）的方法，初步判斷DR1菌株為芽孢桿菌或類芽孢桿菌屬。

2. 3. 3 分子生物學鑒定結果

2. 3. 3. 1 16S rDNA序列分析 測序結果表明，擴增的16S rDNA序列全長1417 bp，將3個陽性克隆送至Thermo Fisher公司測序，獲得的序列在NCBI上經BLASTn軟件同源序列檢索發現，在親緣關系相近的前100個序列中，有解淀粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌2種。以16S rDNA同源性為基礎，選取19個模式菌株的16S rDNA序列與DR1菌株構建系統發育進化樹，結果（圖3）表明，DR1菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）同處于一個最小的分支，與已知模式菌株Bacillus amyloliquefaciens NRRL BD-601（Rooney et al.，2009）的同源性達100%。

2. 3. 3. 2 gyrB基因序列分析 擴增的gyrB基因序列長度為1230 bp，基于gyrB基因序列構建的系統發育進化分析顯示，DR1菌株與解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）菌株JQ658430和DQ309294等聚在同一個分支上，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilies）明顯區分（圖4）。因此，將DR1菌株進一步鑒定為解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）。

2. 4 DR1菌株的田間防效

生防菌DR1處理后不同調查時期荷花腐敗病的發病率及田間防效如表3所示。由表3可知，DR1菌株對荷花腐敗病有一定的防效，不同調查時期相對防效為29.85%～57.26%，平均防效為41.83%（圖5）。不同調查時期生防菌DR1對荷花腐敗病的防效差異顯著，越到發病后期，DR1菌株的防治效果越好。

3 討論

荷花腐敗病是由鐮孢菌（Fusarium commune）引起的重要土傳病害，是荷花產業持續發展的一個重要障礙（葛有茂和趙士熙，2009；胡長志等，2013）。生物防治因無毒、高效、成本低等優點成為病蟲害防治的研究熱點。本研究從106株分離自土壤的細菌中篩選出1株對荷花腐敗病菌及其他6種植物病原真菌具有明顯抑制作用的菌株DR1，經生理生化鑒定、16S rDNA和gyrB基因分析，DR1菌株屬于解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

芽孢桿菌繁殖能力強、營養簡單，且能產生耐熱抗逆的芽孢，有利于其生防菌劑的批量生產及大田推廣應用（陳志誼等，2010；向亞萍等，2016）。許多田間應用研究表明，芽孢桿菌類生防菌劑在穩定性、持效性及與化學農藥相容性等方面均明顯優于非芽孢桿菌類生防菌，芽孢桿菌是在作物病害防治中值得大力開發及大面積推廣利用的生物資源（陳志誼等，2010；洪鵬等，2013）。目前，已報道用于生物防治的芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌（B. subtilies）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）、多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）、地衣芽胞桿菌（B. licheniformis）和蠟狀芽孢桿菌（B. cereus）等（郝華昆等，2007；呂捷等，2014；馮世鑫等，2015；伍善東等，2015）。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）與枯草芽孢桿菌（B. subtilis）的親緣關系非常近，在其生長過程中可以產生抗真菌蛋白、伊枯草菌素、幾丁質酶等代謝產物，這些代謝產物使得解淀粉芽孢桿菌具有廣泛的抗菌活性（Sun et al.，2006；Arrebola et al.，2010；張雪花等，2015）。

荷花真菌性病害是影響荷花生長發育的重要因素。目前荷花上常見的真菌病害有腐敗病（藕瘟）、小菌核葉腐病、葉疫病、褐斑病和炭疽病等（張寶棣等，1996；匡晶等，2015）。由于各種病原菌的生物學特性差異明顯，一種成功的荷花病害生防菌制劑要求所用的生防菌具備較寬的拮抗譜。本研究中篩選到的解淀粉芽孢桿菌DR1能顯著抑制荷花腐敗病菌生長，且對蓮（荷花）小菌核葉腐病、香蕉枯萎病菌、番茄灰霉病菌和火龍果潰瘍病菌等也有較好的拮抗作用，說明這株拮抗菌除對荷花腐敗病菌有抑制效果外，也可用于其他病害的防治，應用前景較好。

本研究田間試驗結果顯示，DR1菌株對荷花腐敗病具有較好的防效，不同發病時期的平均相對防效為41.83%，特別是越到發病后期，DR1菌株的防治效果越好，說明該生防菌的田間防效穩定性及持效性較好。總之，DR1菌株具備較寬的抗菌譜，可產生芽孢，耐熱及抗逆性強，在荷花病害防治中不失為一株有較好開發應用前景的生防菌。但DR1菌株能否在生產上推廣應用，還需對其在土壤及植株上的定殖能力、防效穩定性和生態效應等進行深入研究，并要進一步開展多年多點試驗，以明確其應用潛力。

4 結論

本研究從田間分離到1株對包括荷花腐敗病菌在內的多種植物病原菌均表現良好拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），該菌株的拮抗活性、耐熱性和抗逆性強，且有較寬的抗菌譜，在荷花病害防治中具有較好的開發應用前景。

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（責任編輯 麻小燕）