馬氏珠母貝肉酶解條件優化及其產物活性分析

付晶晶　張艷雯　吳耀生　孫健

摘要：【目的】優化超聲波輔助酶解馬氏珠母貝肉工藝條件，并對酶解產物進行自由基清除活性分析，為馬氏珠母貝肉的高值化利用提供參考依據。【方法】以馬氏珠母貝肉為原料，采用單因素及響應面試驗分析酶解溫度、加酶量、超聲功率和酶解時間對珠母貝肉蛋白質水解度的影響，確定最佳工藝參數，并測定酶解產物對羥基自由基（·OH）、超氧自由基（ ）及DPPH自由基（DPPH·）的清除能力。【結果】影響馬氏珠母貝肉酶解效果的4個因素主次順序為：超聲波功率>加酶量>酶解溫度>酶解時間，其中酶解溫度、加酶量和超聲波功率影響極顯著（P<0.01），酶解時間及加酶量與超聲波功率的交互作用影響顯著（P<0.05）。馬氏珠母貝肉最佳超聲波輔助酶解條件為：酶解溫度48 ℃、加酶量2200 U/g、超聲波功率13%（總輸出功率900 W）、酶解時間12 min，在此條件下的蛋白質水解度為21.937%，與預測值（22.140%）的相對誤差為0.92%。酶解產物對·OH、 和DPPH·的清除能力隨酶解產物質量濃度的增加而增強，當質量濃度為2.0 mg/mL時，清除率分別為68.85%、83.62%和82.36%。【結論】優化得到的超聲波輔助酶解馬氏珠母貝肉工藝參數準確可靠，酶解時間顯著縮短，酶解產物具有明顯的清除自由基活性，可作為具有抗氧化作用的保健食品、保健酒等產品的優質原料。

關鍵詞： 馬氏珠母貝肉；超聲波輔助酶解；響應面法；清除自由基活性

中圖分類號： TS254.9 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）01-0119-08

Abstract：【Objective】The present study optimized ultrasonic-assisted enzymolysis conditions for Pinctada fuctada martensii muscle， and analyzed free radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate， in order to provide reference for value-added utilization of P. fuctada martensii muscle. 【Method】P. fuctada martensii muscle was taken as the material， single factor and response surface methodology were applied to analyze effects of enzymolysis temperature， protease dosage， ultrasonic power and enzymolysis time on degree of hydrolysis（DH） of protein in P. fuctada martensii muscle， and determine the optimum process parameters， and measure scavenging activity of enzymatic hydrolysate on hydroxyl radical（·OH）， superoxide radical（ ） and DPPH free radical（DPPH·）. 【Result】The factors influencing enzymolysis of P. fuctada martensii muscle in order of their effects were as follows： ultrasonic power>protease dosage>enzymolysis temperature>enzymolysis time. Enzymolysis temperature， protease dosage and ultrasonic power had extremely significant difference on enzymolysis（P<0.01）， and interaction between ultrasonic power and enzymolysis time had significant difference（P<0.05）. The optimal enzymolysis condition was as follows： enzymolysis temperature was 48 ℃， protease dosage 2200 U/g， ultrasonic power 13%（total output power was 900 W）， enzymolysis time 12 min. Under such condition， DH of protein was 21.937%， the relative error to expected value（22.140%） was 0.92%. The scavenging activity of enzymatic hydrolysate on ·OH， and DPPH· enhanced as mass concentration of enzymatic hydrolysate increased. When the mass concentration of enzymatic hydrolysate reached 2.0 mg/mL， the scavenging rate for ·OH was 68.85%， scavenging rate for 83.62% and scavenging rate for DPPH· 82.36%. 【Conclusion】The optimized process parameters of ultrasound-assisted enzymolysis are accurate and reliable. Enzymolysis time is shortened and free radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate is obvious. Therefore， the enzymatic hydrolysate can be utilized as raw materials of health care food， health care drinks with antioxidation.

Key words： Pinctada fuctada martensii muscle； ultrasonic-assisted enzymolysis； response surface methodology； free radicals scavenging activity

0 引言

【研究意義】馬氏珠母貝（Pinctada fuctada martensii）又稱合浦珠母貝，主要分布在廣西、廣東和臺灣海峽南部沿海一帶，是我國海水珍珠的主要母貝（吳燕燕等，2015），由其生產的珍珠被稱為南珠。近年來，我國南珠年產量在15～30 t（曹占旺，2011），珠母貝采珠后會產生大量貝肉，按珍珠及貝肉的比例估算，采珠后的貝肉每年為2000～4000 t（章超樺等，2000）。目前我國取珠后剩余的珠母貝肉小部分鮮銷或初加工食用，還有一部分作為飼料原料廉價銷售，其他則直接當作廢棄物，致使貝肉的大部分營養成分尚未得到充分利用，還會造成環境污染（謝莉萍等，2000）。馬氏珠母貝肉是一種營養豐富的產品，其蛋白質含量達81.2%（干基），高于其他常見貝類，且氨基酸種類齊全，含有18種以上常見氨基酸（刁石強等，2000）；多不飽和脂肪酸DHA和EPA的含量較高（方富永等，2007），并富含維生素及多種微量元素。因此，研究馬氏珠母貝肉的深加工技術，對增加其附加值具有重要意義。【前人研究進展】為更好地利用馬氏珠母貝肉資源，不少學者以其或水解產物為主要原料進行了一系列食品的研制，如軟罐頭（張靜等，2008）、調味基料（陳美花等，2010）、烘烤貝肉（姜秋煥等，2012）、調味醬（鄭惠娜等，2012）等，但這些只是附加值較低的初加工產品。對馬氏珠母貝肉活性物質深層次的研究主要集中在活性肽和糖胺聚糖兩方面。艾春媚等（2004）研究表明珠母貝糖胺聚糖對體外培養的新生大鼠顱骨成骨細胞有顯著促進分化和礦化作用，但不能促進細胞增殖；胡雪瓊等（2013）研究表明珠母貝糖胺聚糖具有一定的抗腫瘤作用。由于馬氏珠母貝肉中活性肽的含量高于糖胺聚糖，因此具有較好的深加工潛力。但馬氏珠母貝肉活性肽在貝肉內含量低，只有通過蛋白酶水解母體蛋白質，才能獲得大量具有生物活性的肽制品。郝記明等（2007）利用蛋白酶對馬氏珠母貝肉進行酶解，結果表明，經4～6 h酶解，產物表現出血管緊張素轉換酶抑制劑活性；Wu等（2013）同樣利用蛋白酶酶解馬氏珠母貝肉蛋白，研究珠母貝肉酶解最佳工藝及其抗氧化活性，結果表明，經3 h酶解，水解度為31.2%，此時酶解產物在體內外均表現出較強的抗氧化活性；鄧志程（2015）采用多酶水解的方式對馬氏珠母貝肉進行處理，結果表明，3種蛋白酶同時處理3.5 h，活性肽得率可達55%，酶解產物可極顯著增強經抗原誘導的小鼠免疫應答能力。但在這些研究中，均需進行較長時間的酶解才能獲得活性肽，為提高酶解效率，一些強化方式如超聲被應用于酶解過程。尚軍等（2009）利用響應面法優化超聲波輔助酶解合浦珠母貝肉的工藝條件，發現在超聲波功率160 W、50 ℃條件下處理17 min后再酶解1 h，其水解度為31%；吳燕燕等（2011）利用相同的工藝條件對合浦珠母貝肉進行超聲波輔助酶解，并對酶解產物清除自由基能力進行測定，結果表明，合浦珠母貝肉抗氧化肽對DPPH自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的清除率分別為77.7%和33.5%。【本研究切入點】超聲分為發散式和聚能式兩種，二者產生超聲波的方式存在本質差別，聚能式超聲波的換能器可與反應液直接接觸，具有更強的超聲強度。已有的相關研究均采用發散式超聲波進行酶解，但鮮見利用聚能式超聲波輔助酶解馬氏珠母貝肉及其酶解產物清除自由基活性的相關報道。【擬解決的關鍵問題】在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化蛋白酶水解馬氏珠母貝肉的工藝條件，并通過自由基清除能力體系評價酶解產物的體外抗氧化活性，以獲得具有較高活性的抗氧化肽，為馬氏珠母貝肉的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

馬氏珠母貝購于廣西合浦，開珠后取新鮮貝肉，凍藏備用。木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶購自南寧龐博生物工程有限公司。茚三酮、甘氨酸等試劑均為國產分析純。主要儀器設備：UV- 9100紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；TDL-5-A離心機（上海安亭科學儀器廠）；JY92- DN超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；DK-S24型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；FE20 pH計（梅特勒—托利多公司）；UV- 2802s分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 馬氏珠母貝肉酶解 馬氏珠母貝肉解凍，經組織搗碎勻漿機破碎后進行超聲輔助酶解，沸水浴滅酶，離心后測定蛋白質水解度。

1. 2. 2 蛋白質水解度測定 采用茚三酮顯色法測定馬氏珠母貝肉蛋白質水解度（趙新淮和馮志彪，1994）。其中，根據謝麗蒙等（2013）的方法計算得到馬氏珠母貝肉htot為7.85 mmol/g，涉及的馬氏珠母貝肉樣品中氨基酸含量數據來源于郝記明（2005）的研究結果。

1. 2. 3 最適蛋白酶選擇 加酶量為4000 U/g，在各種酶的最適反應條件下（表1）對馬氏珠母貝肉進行酶解，酶解時間1 h，測定不同蛋白酶酶解后的蛋白質水解度。根據結果篩選出對馬氏珠母貝肉酶解效果最佳的蛋白酶。

1. 2. 4 單因素試驗 考察不同酶解溫度（40、45、50、55和60 ℃）、加酶量（1000、1500、2000、2500和3000 U/g）、超聲波功率（0、5%、10%、15%、20%和25%）（超聲波細胞破碎儀輸出功率900 W，試驗超聲波功率參數用輸出功率的百分數表示）及酶解時間（6、8、10、12和14 min）對1.2.3選擇的蛋白酶水解馬氏珠母貝肉的影響。酶解結束后，沸水浴10 min滅酶，測蛋白質水解度。

1. 2. 5 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上，選取每個因素中較優的3個水平進行響應面設計，共29個試驗點（5個中心點），以優化蛋白酶水解馬氏珠母貝肉條件。響應面試驗設計因素與水平見表2。

1. 2. 6 清除自由基活性測定 將馬氏珠母貝肉酶解產物減壓濃縮后用無水乙醇調節醇濃度至80%，靜置1 h后離心，上清液減壓濃縮后進行冷凍干燥。參照Yao等（2011）的方法，將干燥產物分別進行·OH、超氧自由基（ ）和DPPH·清除試驗。

1. 3 統計分析

所有試驗均重復3次，取平均值。對單因素試驗數據進行One-way ANOVA方差分析，采用Design Expert 8.0.5對響應面試驗結果進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 最適蛋白酶的選擇 由圖1可知，4種蛋白酶對馬氏珠母貝肉酶解效果差異顯著（P<0.05，下同），以中性蛋白酶對馬氏珠母貝肉的蛋白質水解度最高，極顯著高于其他3種蛋白酶的水解度（P<0.01，下同）。為了能短時間內獲得較好的酶解效果，故選擇中性蛋白酶作為單因素及響應面試驗的蛋白水解酶；中性蛋白酶的最適pH為7.0，因此后續試驗酶解過程均調節pH為7.0。

2. 1. 2 酶解溫度對馬氏珠母貝肉蛋白質水解度的影響 由圖2可知，在固定加酶量2000 U/g、超聲波功率15%、酶解時間10 min的條件下，酶解溫度為40～45 ℃時，隨著酶解溫度的升高，馬氏珠母貝肉蛋白質水解度顯著增加；酶解溫度為45～60 ℃時，隨著酶解溫度的升高，蛋白質水解度逐漸降低，可能是高溫會使酶的活性降低。因此，選取酶解溫度40、45和50 ℃ 3個水平進行響應面試驗。

2. 1. 3 加酶量對馬氏珠母貝肉蛋白質水解度的影響 由圖3可知，在固定超聲波功率15%、酶解溫度50 ℃、酶解時間10 min的條件下，加酶量為1000～2000 U/g時，隨著加酶量的增加，馬氏珠母貝肉蛋白質水解度迅速增加，超過2000 U/g后，加酶量對蛋白質水解度無顯著影響（P>0.05）。其原因可能是蛋白酶濃度較低時，其可與溶液中溶解的蛋白迅速結合并水解，但隨著加酶量的增加，酶逐漸達飽和狀態，水解效率趨于平緩。因此，選取加酶量1500、2000和2500 U/g 3個水平進行響應面試驗。

2. 1. 4 超聲波功率對馬氏珠母貝肉蛋白質水解度的影響 由圖4可知，在固定加酶量2000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間10 min的條件下，超聲波功率為0～15%時，馬氏珠母貝肉蛋白質水解度隨超聲波功率的增大而不斷增加，可能是超聲波產生的空化效應釋放巨大能量，破壞細胞結構，增強傳質效率，使酶和底物的活性部位更易結合，從而增加反應速度，縮短反應時間（尚軍等，2009）。但超聲波功率超過15%后，蛋白質水解度有所降低，可能是由于聚能式超聲波功率過高會破壞蛋白酶結構，此外超聲波的熱效應也對蛋白酶的活性有一定影響，從而降低蛋白質的水解度。因此，選取超聲波功率10%、15%和20% 3個水平進行響應面試驗。

2. 1. 5 酶解時間對馬氏珠母貝肉蛋白質水解度的影響 由圖5可知，在固定加酶量2000 U/g、超聲波功率15%、酶解溫度50 ℃的條件下，酶解時間為6～10 min時，隨著酶解時間的延長，馬氏珠母貝肉蛋白質水解度顯著增加，在10～12 min時蛋白質水解度增速緩慢；酶解12～14 min時，隨著酶解時間的延長，蛋白質水解度不再升高。其原因可能是超聲波的剪切作用比較強烈，長時間超聲會使酶結構遭受破壞。因此，選取酶解時間10、12和14 min 3個水平進行響應面試驗。

2. 2 響應面分析法優化結果

2. 2. 1 回歸方程的建立 利用Design Expert 8.0.5對響應面試驗數據（表3）進行回歸分析，得到蛋白酶水解馬氏珠母貝肉的蛋白質水解度對各因素的回歸模型方程：

Y=21.45+0.56A+0.88B-1.74C+0.28D+0.19AB+

0.058AC-0.024AD-0.45BC-0.26BD-0.045CD-

0.59A2-1.31B2-2.47C2-0.68D2

2. 2. 2 回歸方程方差分析結果 表4為回歸方程的方差分析和顯著性檢驗。由表4可以看出，F=60.33，P<

0.0001，說明該模型有效可靠，達極顯著水平，有意義。失擬項P=0.0992>0.05，不顯著，表明對模型有利。回歸模型R2=0.9837，說明該模型相關性較好，R2Adj=0.9674，說明該模型能解釋96.74%響應值的變化。CV=1.74%，說明試驗的可信度較高。精密度大于4為合理，本研究精密度=24.556，表明是一個適宜的信號。模型中A、B、C、A2、B2、C2、D2對試驗結果影響達極顯著水平， D、BC對試驗結果影響達顯著水平。由F可判斷對蛋白質水解度影響的4個因素主次順序為：超聲波功率>加酶量>酶解溫度>酶解時間。

2. 2. 3 響應面分析結果 通過Design Expert 8.0.5對因素間的交互作用進行響應面分析，得到各因素交互作用的響應面圖（圖6）。從圖6可看出，各因素對響應值蛋白質水解度的影響均存在最大值，各因素在較低范圍內隨水平的增加，響應值逐漸增大；當響應值增大到極值后，隨著因素水平的繼續增加，響應值逐漸減小。在交互項對蛋白酶水解馬氏珠母貝肉的影響中，加酶量與超聲波功率對蛋白質水解度的交互效應最顯著。由圖6還可知，超聲波功率對蛋白質水解度的影響最顯著，曲線最陡峭；加酶量、酶解溫度對蛋白質水解度的影響較顯著，曲線較陡；而酶解時間對蛋白質水解度的影響最小，曲線較平緩，酶解時間的改變對響應值的變化影響較小。

2. 2. 4 驗證試驗結果 回歸模型預測蛋白酶水解馬氏珠母貝肉的理論最佳工藝條件為：酶解溫度47.63 ℃、加酶量2213.13 U/g、超聲波功率13.07%、酶解時間12.26 min，在此條件下，蛋白質水解度的理論值為22.140%。考慮到可操作性，將最優條件調整為：酶解溫度48 ℃、加酶量2200 U/g、超聲波功率13%、酶解時間12 min，通過3組平行試驗進行驗證，得到實際蛋白質水解度為21.937%，與理論值的相對誤差為0.92%，說明模型準確可靠，對優化蛋白酶水解馬氏珠母貝肉工藝具有實用價值。

2. 3 馬氏珠母貝肉酶解產物清除自由基活性測定結果

為驗證獲得的馬氏珠母貝肉酶解產物是否具有清除自由基活性，分別對其進行清除·OH、 和DPPH·試驗，以維生素C為對照，結果見圖7。在試驗濃度范圍內，隨著酶解產物質量濃度的升高，其清除自由基的能力逐漸增強。當酶解產物質量濃度為2.0 mg/mL時，其對·OH、 和DPPH·的清除率分別為68.85%、83.62%和82.36%。表明獲得的酶解產物具有較強的清除自由基活性。

3 討論

目前，馬氏珠母貝肉活性肽的獲取主要通過蛋白酶對貝肉蛋白進行水解得到，時間較長，一般需3～6 h。為了縮短酶解時間，本研究采用聚能式超聲波輔助酶解法對馬氏珠母貝肉蛋白進行水解，通過單因素及響應面試驗優化條件，得到最優酶解條件為：酶解溫度48 ℃、加酶量2200 U/g、超聲波功率13%、酶解時間12 min，在此條件下的蛋白質水解度為21.937%；雖然略低于尚軍等（2009）采用發散式超聲波輔助酶解馬氏珠母貝肉得到的蛋白質水解度（31%），但酶解時間縮短48 min。可見，聚能式超聲波強度更大，短時間內（12 min）即可獲得較高的蛋白質水解度。

本研究單因素試驗考察酶解溫度、加酶量、超聲波功率和酶解時間4個因素對馬氏珠母貝肉酶解效果的影響，在酶解溫度的選擇試驗中，45 ℃的蛋白質水解度達最高值，與廠家推薦的中性蛋白酶的最適溫度（50 ℃）有所偏差，但45 ℃與50 ℃的蛋白質水解度無顯著差異，分析原因可能是單因素試驗中均加有15%超聲波功率，對酶的最適溫度有一定影響；在超聲波功率的選擇試驗中，發現在未加超聲波的情況下，酶解后馬氏珠母貝肉蛋白質水解度顯著低于超聲波處理的蛋白質水解度，其原因可能是本研究采用聚能式超聲波進行強化處理，考慮預處理成本問題，對原料僅進行簡單勻漿，處理后原料顆粒度較大，故在未加超聲波的條件下，酶首先與溶液中游離的底物及顆粒表面的底物進行反應，很短時間已經反應充分，而顆粒內部的蛋白質很難與酶接觸。

酶解得到的活性肽生物活性與水解度間存在較大的關聯性。一般在水解度較低的情況下，活性肽清除自由基的能力會隨著水解度的提高逐漸增強，但水解度超過一定值后，活性肽清除自由基的能力反而會隨著水解度的提高逐漸降低（劉偲琪等，2014），因此在制備抗氧化肽的過程中不應將水解度作為唯一參考指標。本研究的馬氏珠母貝肉蛋白質水解度為21.937%，酶解產物在2.0 mg/mL質量濃度下對·OH、 和DPPH·的清除率分別為68.85%、83.62%和82.36%，高于胡雪瓊等（2009）的研究結果，且達到或超過一些具有清除自由基活性的天然產物，如瑪卡多糖（Zha et al.，2014）、玉米抗氧化肽（Jin et al.，2016）。此外，雖然本研究的蛋白水解度較尚軍（2010）的研究結果（33.8%）低，但具有更高的清除自由基活性，該結果與曹文紅等（2009）研究發現當蛋白質水解度介于15%～25%時，馬氏珠母貝肉酶解產物具有更高清除自由基活性的結論一致。馬氏珠母貝肉蛋白質水解度為21.937%時，其清除自由基的活性已達到較高值，該結果可為利用馬氏珠母貝肉生產生物活性肽相關產品提供參考依據。本研究僅考察了單一蛋白質水解度下的自由基清除活性，下一步將系統研究二者間的關系，對于生產實踐將具有更好的指導意義，并進行酶解產物氨基酸序列分析，對于闡明抗氧化肽構效關系也有一定幫助。

4 結論

優化得到的超聲波輔助酶解馬氏珠母貝肉工藝參數準確可靠，酶解時間顯著縮短，酶解產物具有明顯的清除自由基活性，可作為具有抗氧化作用的保健食品、保健酒等產品的優質原料。

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（責任編輯 羅 麗）