腎虛證骨質(zhì)疏松與β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的相關(guān)性研究?

肖延華，唐德志

(1. 井岡山大學(xué)，江西 吉安 343009；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

【實(shí)驗(yàn)研究】

腎虛證骨質(zhì)疏松與β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的相關(guān)性研究?

肖延華1，唐德志2

(1. 井岡山大學(xué)，江西 吉安 343009；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

目的：探索腎虛證骨質(zhì)疏松與β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的相關(guān)性。方法：去卵巢復(fù)制腎虛證骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，將Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠、野生型小鼠、Axin2基因敲除小鼠分別按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組和模型組，于造模1個(gè)月后分離相應(yīng)組織進(jìn)行X-gal染色和細(xì)胞β-gal活性檢測(cè)以及Micro-CT掃描分析骨量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，腎虛證模型組Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟組織和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性均被明顯抑制。Micro-CT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)Axin2基因敲除可明顯抑制小鼠去卵巢所致的脛骨骨量減少。結(jié)論：腎虛型骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病病理機(jī)制與β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路失活密切有關(guān)，通過(guò)激活β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路可明顯抑制腎虛引起的骨質(zhì)疏松。

腎虛；骨質(zhì)疏松；β-Catenin；信號(hào)傳導(dǎo)通路；去卵巢

“腎主骨”理論是中醫(yī)臟腑理論的核心內(nèi)容之一，在防治骨質(zhì)疏松癥方面具有重要的理論和臨床價(jià)值。中醫(yī)學(xué)關(guān)于“腎主骨”的辨證論治積累了豐富的診療經(jīng)驗(yàn)，至今仍然發(fā)揮著重要作用，但是對(duì)于“腎主骨”理論的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵仍未清楚。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，β-鏈蛋白(β-Catenin)信號(hào)傳導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)骨量方面具有關(guān)鍵作用。本研究利用Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠(β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路報(bào)告基因小鼠)和Axin2基因敲除小鼠(β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路活性增強(qiáng)小鼠)，深入研究腎虛骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步揭示“腎主骨”理論的內(nèi)在規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

所有的小鼠實(shí)驗(yàn)研究均按照上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)核準(zhǔn)的程序進(jìn)行。選擇8只雌性6月齡Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和假手術(shù)組各4只；選擇20只雌性6月齡Axin2基因敲除小鼠和20只雌性6月齡野生型小鼠，分別按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和假手術(shù)組各10只。

1.2 藥品及試劑

胎牛血清(美國(guó)PAA公司)，a-MEM干粉培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，青-鏈霉素(美國(guó)PAA公司), 吐溫-80、乙醇、多聚甲醛、二甲苯、甲醛、甲基丙桸酸甲酯等生化試劑(上海思吉公司)，X-gal染色試劑盒(美國(guó)Sigma公司)和細(xì)胞β-gal活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(熱能公司)、SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(AIRTECH公司)、倒置相差顯微鏡(Olympus公司)、AF100制冰機(jī)(SCOTMAN公司)、高速離心機(jī)(Eppendorf公司)、VivaCT 40Micro-CT(Scanco Medical AG公司)、LEICA SM 2500E組織切片機(jī)(LEICA公司)和FLUO-STAR熒光檢測(cè)儀(Promega 公司)等。

1.4 造模方法

腎虛證動(dòng)物模型采用去卵巢小鼠模型。小鼠經(jīng)氯胺酮(0.1 g/kg)腹腔注射麻醉后取俯臥位，肋弓下第3～4腰椎處剔凈鼠毛，碘伏消毒，無(wú)菌操作下經(jīng)腰背側(cè)正中入路進(jìn)入，鈍性分開(kāi)腰部筋膜、肌肉，切開(kāi)腹膜分離暴露卵巢，結(jié)扎輸卵管和周?chē)芎笳殉玻缓蟀聪嗤椒ㄕ龑?duì)側(cè)卵巢。在確保摘除雙側(cè)卵巢后逐層縫合腹膜至皮膚，慶大霉素注射傷口。假手術(shù)組不摘除卵巢，僅摘除雙側(cè)卵巢旁邊少許脂肪組織。

1.5 組織X-gal染色和細(xì)胞β-gal活性檢測(cè)

將Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠按上述方法造模，于造模1個(gè)月后處死小鼠，分別取腎臟和卵巢組織進(jìn)行X-gal染色，以檢測(cè)β-Catenin信號(hào)的表達(dá)情況。同時(shí)分別取股骨和脛骨，剔凈周?chē)浗M織。剪除兩端骨組織暴露骨髓腔，緩慢從一端注入含 10% FBS、100 U/ml青-鏈霉素的高糖α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，以分離獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)。將細(xì)胞以1×106個(gè)/ml的密度接種在6孔培養(yǎng)板上，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)裂解細(xì)胞提取蛋白，按照細(xì)胞β-gal活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行β-gal活性檢測(cè)。

1.6 Micro-CT分析

將Axin2基因敲除小鼠和野生型小鼠分別按上述方法造模，于造模1個(gè)月后處死小鼠取脛骨組織進(jìn)行Micro-CT掃描，10 μm的分辨率，55 kVp，145 mA，300 ms。簡(jiǎn)而言之，在股骨掃描從較低的生長(zhǎng)板開(kāi)始10 μm向下延伸350層，形態(tài)學(xué)分析從生長(zhǎng)板完全暴露為第1層開(kāi)始延伸到150層。然后每層自動(dòng)成像，重建三維結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)分析，并采用μCT評(píng)估軟件系統(tǒng)定量分析骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV (%)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 組織切片X-gal染色

圖1顯示，在假手術(shù)組Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠的雙側(cè)卵巢組織中存在較多的X-gal染色陽(yáng)性信號(hào)，表明在正常的卵巢組織中β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路保持著較高水平的激活狀態(tài)，以維持卵巢的功能。在腎虛證模型組Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠由于雙側(cè)卵巢均被摘除，導(dǎo)致這種激活的β-Catenin信號(hào)則完全消失。結(jié)果提示，腎虛證小鼠模型卵巢組織中β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性降低。

圖1 假手術(shù)組Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠雙側(cè)卵巢組織X-gal染色比較

圖2顯示，在假手術(shù)組Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠的雙側(cè)腎臟組織中亦存在較多的X-gal染色陽(yáng)性信號(hào)，表明在正常的腎臟組織中β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路保持著較高水平的激活狀態(tài)，以維持腎臟的功能。在去卵巢所致的腎虛證模型組Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠的雙側(cè)腎臟組織中，X-gal染色陽(yáng)性信號(hào)則顯著減少，表明在腎虛證動(dòng)物模型的腎臟組織中β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性被明顯抑制，導(dǎo)致腎臟失去正常的功能。結(jié)果提示，腎虛證小鼠模型腎臟組織中β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性降低。

圖2 各組Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠雙側(cè)腎臟組織X-gal染色比較

2.2 細(xì)胞β-gal活性檢測(cè)

表1顯示，與假手術(shù)組Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠比較，模型組小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)中β-gal活性明顯減少(P<0.05)，表明在腎虛證動(dòng)物模型BMSCs中β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性被明顯抑制，導(dǎo)致BMSCs的增殖和分化發(fā)生異常。

組 別鼠數(shù)細(xì)胞β?gal活性變化假手術(shù)組41 02±0 11模型組40 39±0 07?

注：與假手術(shù)組比較:*P<0.05

2.3 脛骨Micro-CT檢測(cè)

圖3顯示，從脛骨骨小梁三維重建結(jié)果可以看出，與假手術(shù)組野生型小鼠比較，模型組野生型小鼠骨量明顯減少，假手術(shù)組Axin2基因敲除小鼠骨量明顯增加。

表2顯示，從脛骨骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)定量分析結(jié)果可以看出，與假手術(shù)組野生型小鼠比較，模型組野生型小鼠BV/TV明顯減少(P<0.05)。與假手術(shù)組基因敲除小鼠比較，模型組基因敲除小鼠BV/TV明顯減少(P<0.05)。與假手術(shù)組野生型小鼠比較，假手術(shù)組基因敲除小鼠骨量明顯增加(P<0.05)。與模型組野生型小鼠比較，模型組基因敲除小鼠骨量明顯增加(P<0.05)。這些結(jié)果表明，Axin2基因敲除可抑制因去卵巢而引起的骨量減少，提示激活β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在治療腎虛型骨質(zhì)疏松癥中具有重要價(jià)值。

圖3 各組小鼠脛骨Micro-CT檢測(cè)比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)所說(shuō)的“腎”實(shí)際包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)功能，而且還與神經(jīng)、內(nèi)分泌、血液等系統(tǒng)密切相關(guān)，包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的腎臟。從胚胎學(xué)等方面也證明，腎與骨在發(fā)生學(xué)上是同源器官，皆發(fā)生于中胚層[1]。現(xiàn)代生理病理學(xué)研究表明，腎與骨的聯(lián)系存在物質(zhì)基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：一是通過(guò)腎小管上皮細(xì)胞的1-羥化酶系統(tǒng)和24-羥化酶系統(tǒng)介導(dǎo)活性維生素D來(lái)調(diào)節(jié)鈣、磷的吸收和代謝。慢性腎功能不全(chronic renal insufficiency, CRI)患者往往出現(xiàn)一系列骨病和鈣磷代謝紊亂，稱(chēng)為腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良(Hypoparathyroidismrenal osteodystrophy)或腎性骨病(Enal osteodystrophy)；二是內(nèi)分泌系統(tǒng)及其分泌的激素，如腎上腺皮質(zhì)激素、生長(zhǎng)激素、甲狀旁腺素和性激素等，與骨的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝有著十分密切的關(guān)系[2-3]。沈自尹院士等采用“同病異證組”進(jìn)行觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛證患者尿17羥皮質(zhì)類(lèi)固醇值(反映腎上腺皮質(zhì)功能)均明顯低下，從而證明腎陽(yáng)虛證有特定的內(nèi)分泌物質(zhì)基礎(chǔ)。目前對(duì)于鈣磷代謝和內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)在“腎主骨”理論中如何發(fā)揮作用的研究較多，但對(duì)于細(xì)胞因子、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路如何參與調(diào)控“腎主骨”的研究較少。

組 別野生型小鼠基因敲除小鼠鼠數(shù)BV/TV(%)鼠數(shù)BV/TV(%)假手術(shù)組108 1±0 91012 6±1 5?模型組104 2±0 7?108 1±0 8﹟△

注：與假手術(shù)組野生型小鼠比較:*P<0.05；與假手術(shù)組基因敲除小鼠比較:﹟P<0.05；與模型組野生型小鼠比較:△P<0.05

近年來(lái)越來(lái)越多的研究結(jié)果表明[4]， Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在腎臟和骨的形成和發(fā)育及功能代謝活動(dòng)中具有重要作用[5-7]。有學(xué)者利用攜帶有β-Catenin特異性靶基因TCF/β-gal啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因小鼠(Topgal轉(zhuǎn)基因小鼠)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路活性在腎小管的形成過(guò)程中保持著較高的水平，Wnt4和Wnt9b在腎間質(zhì)、腎小管和輸尿管中均高表達(dá)。體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞(madin-darby canine kidney，MDCK)中，Wnt4可激活經(jīng)典的Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路[8]。在腎祖母細(xì)胞中特異性敲除β-Catenin導(dǎo)致腎單位的數(shù)量減少和結(jié)構(gòu)紊亂。從前面論述中可知，Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路亦在調(diào)控骨發(fā)生、發(fā)育和重塑過(guò)程中具有重要作用。這些研究結(jié)果表明，Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路可能與中醫(yī)“腎主骨”理論密切相關(guān)。

為研究中醫(yī)“腎主骨”理論的內(nèi)在規(guī)律，首先必須建立一個(gè)理想的腎虛證骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物去卵巢后雌激素缺乏導(dǎo)致骨丟失，其病變過(guò)程、轉(zhuǎn)歸與婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松非常相似，通過(guò)摘除雙側(cè)卵巢以建立腎虛證骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型已得到公認(rèn)并廣泛采用[9]。本實(shí)驗(yàn)利用去卵巢小鼠腎虛證骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性在腎虛型骨質(zhì)疏松性小鼠的腎臟和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中顯著下降，說(shuō)明腎虛證骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病病理機(jī)制與β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失活密切相關(guān)。

Axin2是β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的負(fù)向調(diào)控因子，通過(guò)敲除Axin2基因可以持續(xù)性激活β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路[10]。為進(jìn)一步研究β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在腎虛引起的骨量丟失中的作用，我們分別對(duì)雌性6月齡Axin2 基因敲除小鼠和同窩出生的野生型小鼠實(shí)施去卵巢摘除手術(shù)，術(shù)后4周處死小鼠，取脛骨組織進(jìn)行Micro-CT掃描分析發(fā)現(xiàn)，Axin2基因敲除可以顯著逆轉(zhuǎn)由于去卵巢導(dǎo)致的骨量丟失。這一結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)激活β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路，可明顯抑制腎虛引起的骨質(zhì)疏松，進(jìn)一步表明β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在參與調(diào)控“腎主骨”過(guò)程中具有重要作用。腎精充足，則β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路處于較高水平的激活狀態(tài)，使骨髓生化有源，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致骨骼得到骨髓的滋養(yǎng)而堅(jiān)固有力。若腎精不足，則β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路活性降低，使骨髓生化失源，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化發(fā)生障礙，不能營(yíng)養(yǎng)骨骼，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。這可能是中醫(yī)“腎主骨”理論的內(nèi)在規(guī)律之一。

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國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473701)-健脾補(bǔ)腎方調(diào)控肌肉微環(huán)境治療骨質(zhì)疏松性骨折的研究；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)新優(yōu)青培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(XYQ2013085)-益氣化瘀補(bǔ)腎方及拆方介導(dǎo)β-catenin信號(hào)通路延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的機(jī)制研究

肖延華(1980-)，男，江西吉安人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事中醫(yī)骨傷科疾病的防治研究。

△通訊作者：唐德志，Tel: 021-64286239，E-mail: dztang702@126.com。

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2016-08-17