新血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化模型大鼠主動脈形態及免疫調節因子HMGB-1、 Foxp3表達的影響?

姜 婷，紀文巖△，隋永妮，劉妮娜，吉中強

(1.青島市海慈醫療集團(青島市中醫醫院)，山東 青島 266033;2.青島市中心醫院，山東 青島 266042)

【實驗研究】

新血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化模型大鼠主動脈形態及免疫調節因子HMGB-1、 Foxp3表達的影響?

姜 婷1，紀文巖1△，隋永妮2，劉妮娜1，吉中強1

(1.青島市海慈醫療集團(青島市中醫醫院)，山東 青島 266033;2.青島市中心醫院，山東 青島 266042)

目的: 觀察新血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化模型大鼠主動脈HMGB-1、Foxp3表達及病理形態學影響，探討其調節免疫因子抗動脈粥樣硬化的作用機制。方法: 雄性SPF級Wistar大鼠48只，按隨機數字表法分為空白對照組、模型組、立普妥組、新血府逐瘀湯(NXFZY)低劑量組、NXFZY高劑量組及NXFZY+立普妥組。除空白組外，其余各組復制動脈粥樣硬化模型，NXFZY低劑量組新血府逐瘀湯9 g/(kg·d)、NXFZY高劑量組新血府逐瘀湯18g/(kg·d)灌胃，立普妥組給予阿托伐他汀鈣2 mg/(kg·d)水溶液灌胃，對照組及模型組灌服等容積生理鹽水，8周后HE染色后鏡下觀察胸主動脈病理學改變，免疫組織化學法檢測胸主動脈HMGB-1、Foxp3表達并進行相關性分析。結果: 與模型組比較，新血府逐瘀湯可顯著降低HMGB-1表達，升高Foxp3表達，兩者存在顯著負相關性。結論：新血府逐瘀湯可通過下調促炎因子HMGB-1、上調抗炎因子Foxp3表達，調節AS過程中促炎與抗炎因子之間的平衡，發揮抗AS的作用。

新血府逐瘀湯；動脈粥樣硬化；免疫調節因子；高遷移率族蛋白B1；叉頭翼狀螺旋轉錄因子P3

免疫與炎癥是目前防治動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的公認靶點[1]，抗炎因素與致炎因素的相互作用決定AS發生發展的進程[2]。他汀類調脂藥物雖然也有抑制免疫炎癥的作用，但因肝腎功能及肌肉損害等問題一定程度上限制了此類藥物的應用范圍[3]，因此如何發揮中藥復方在抗AS中的多靶點協同作用優勢，值得深入研究。本實驗觀察新血府逐瘀湯(NXFZY)對AS大鼠主動脈免疫調節因子高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB-1)、叉頭翼狀螺旋轉錄因子P3(Foxp3)表達影響及病理形態學改變，探討其抗AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質量(200±10)g，符合一級實驗動物質量標準(動物合格證號SCXK(魯)20130004)。

1.2 實驗藥物

1.2.1 中藥 新血府逐瘀湯組成：桃仁12 g，紅花、生地、當歸、澤瀉、牛膝、首烏各9 g，枳實、赤芍、生山楂各6 g，川芎4.5 g。經浸泡、煎煮、過濾、濃縮制成煎劑，真空包裝，其中高、低劑量每毫升含生藥分別為2.0 g、1.0 g，低溫冷藏備用。

1.2.2 西藥 阿托伐他汀鈣(立普妥，10 mg/片，美國輝瑞制藥有限公司，生產批號1337119)，丙硫氧嘧啶(上海朝暉，生產批號1307F02)，注射用維生素 D3(上海通用制藥股份有限公司，生產批號12115)。

1.3 主要試劑及儀器

Rb polyclonal to HMGB-1Antibody (abcam，批號GR93186-2)，工作濃度1∶50；Ms polyclonal to Foxp3 Antibody (abcam，批號GR146107-3)，工作濃度1∶50；羊抗兔二抗(abcam，批號GR101082-1)，工作濃度為1∶500；羊抗鼠二抗(abcam，批號GR101081-1)，工作濃度1∶500；兔抗羊二抗(abcam，批號GR101083-1)，工作濃度1∶500。DAB顯色試劑盒(北京中衫金橋生物技術有限公司)、光學顯微鏡(BX43型，OLYMPUS公司)、輪轉式切片機(RM2235型，LEICA公司)、病理組織漂烘儀(tec 2500型，常州市郝思琳儀器設備有限公司)等。

2 方法

2.1 分組及造模

常規飼養1周后，采用隨機數字表法將48只雄性Wistar大鼠分成對照組、模型組、立普妥組、NXFZY低劑量組、NXFZY高劑量組和NXFZY+立普妥組6組各8只。對照組進食基礎飼料(53%碳水化合物，9%脂肪，21%蛋白質)，其余各組喂食高脂飼料(1%膽固醇，5%豬油，0.5%膽酸鈉，0.2%丙硫氧嘧啶，93.3%普通飼料)直至取材。建模采用文獻[4]的方法，模型組及藥物干預組大鼠從實驗第1天開始即喂食高脂飼料，實驗開始時腹腔注射維生素D3(每次注射17.5萬IU/kg，隔2 d注射1次，共注射4次)。

2.2 給藥

造模第3周后，NXFZY低、高劑量組分別以新血府逐瘀湯低劑量、高劑量煎劑10 ml/(kg·d)灌胃，qd；立普妥組給予阿托伐他汀鈣2 mg/(kg·d)水溶液灌胃，qd；NXFZY+立普妥組上述2種方案相加給藥；對照組及模型組則分別灌服等容積生理鹽水；連續灌胃8周，每周稱重1次，根據體質量調整用藥量。

2.3 組織病理學觀察

8周后麻醉大鼠，切開胸腹常規貼片、脫臘、HE染色，用ipp6.0專業圖像分析軟件測量胸主動脈內膜和中膜厚度。

2.4 免疫組化法檢測HMGB-1、Foxp3表達

按試劑盒說明步驟進行免疫組化染色，每張免疫組化切片隨機選擇3個不同的視野(×200)微鏡下觀察，染色結果判定參照文獻[5]中的方法，對每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比乘積評分，評價其陽性表達強度及陽性率。

2.5 統計學方法

3 結果

實驗過程中3只大鼠死亡，因灌藥不慎導致立普妥組和NXFZY高劑量組各有1只老鼠死亡，另有模型組1只老鼠死于腹瀉。

3.1 6組大鼠胸主動脈病理形態學觀察

圖1顯示，各組大鼠胸主動脈給予HE染色后進行鏡下觀察，大鼠主動脈粥樣硬化模型組主動脈內膜顯著增厚，中膜平滑肌細胞增殖，可見脂質斑塊和泡沫細胞積聚及壞死深染物質，動脈壁三層結構紊亂，提示AS模型建立成功；各治療組主動脈粥樣硬化斑塊病變程度較模型組不同程度減輕，尤其是NXFZY+立普妥組主動脈內膜結構完整，中膜平滑肌細胞排列較為規則，未見硬化斑塊產生，各層結構尚清晰，提示新血府逐瘀湯與阿托伐他汀鈣聯用能有效抑制AS斑塊的形成。

3.2 6組大鼠胸主動脈內膜、中膜厚度比較

表1顯示，與模型組比較，立普妥組、NXFZY高劑量組、NXFZY+立普妥組內膜及中膜厚度不同程度降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；其中NXFZY+立普妥組降低內膜及中膜厚度較單純立普妥組更明顯(P<0.05)；NXFZY高劑量組內膜厚度低于NXFZY低劑量組，且差異有統計學意義(P<0.05)。

3.3 免疫組化法檢測6組大鼠胸主動脈HMGB-1、Foxp3表達結果

表1圖2、3顯示，與空白組比較，模型組HMGB-1陽性表達明顯增高，Foxp3顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，各治療組HMGB-1陽性表達水平不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，其中NXFZY高劑量組與NXFZY+立普妥組HMGB-1水平降低明顯(P<0.01)；NXFZY高劑量組、NXFZY+立普妥組Foxp3陽性表達升高差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。組間比較，NXFZY+立普妥組降低HMGB-1，升高Foxp3陽性表達水平，與單純立普妥組比較差異有統計學意義(P<0.05)；NXFZY高劑量組HMGB-1陽性表達水平低于NXFZY低劑量組(P<0.05)，Foxp3陽性表達均值較低劑量組升高，但差異無統計學意義(P>0.175)。

圖1 各組大鼠胸主動脈病理形態學觀察(×200)注：A.對照組；B.模型組；C.立普妥組；D.NXFZY低劑量組；E.NXFZY高劑量組；F.NXFZY+立普妥組

組 別例數內膜厚度/pixel中膜厚度/pixelHMGB?1Foxp3空白組873 24±18 335358 33±39 5424 12±0 4856 47±1 328模型組792 43±8 084△△474 24±52 774△△6 10±1 518△△4 30±1 490△△立普妥組781 38±6 764▲434 86±81 841▲5 14±1 621▲4 76±1 179NXFZY低劑量組888 67±8 331445 61±83 4995 25±1 422▲4 75±1 422NXFZY高劑量組780 43±15 977▲?427 81±49 813▲4 38±1 499▲▲?5 33±1 932▲NXFZY+立普妥組873 08±14 301▲▲●387 83±60 514▲▲●4 29±1 301▲▲●5 67±1 404▲▲●

注：與空白組比較:△△P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01；與立普妥組比較:●P<0.05；與NXFZY低劑量組比較:*P<0.05

圖2 各組大鼠胸主動脈HMGB-1表達(×200)注：A.對照組；B.模型組；C.立普妥組；D.NXFZY低劑量組；E.NXFZY高劑量組；F.NXFZY+立普妥組

圖3 各組大鼠胸主動脈Foxp3表達(×200)注：A.對照組；B.模型組；C.立普妥組；D.NXFZY低劑量組；E.NXFZY高劑量組；F.NXFZY+立普妥組

3.4 動脈粥樣硬化大鼠主動脈HMGB-1、Foxp3的相關性分析

分析45只AS大鼠主動脈HMGB-1、Foxp3陽性表達評分結果相關性，結果顯示兩者之間相關系數(r=-0.627)呈顯著負相關(P<0.01)。

4 討論

AS是一種多種免疫因素參與、復雜的慢性炎癥性疾病[6]，炎癥貫穿于AS發生、發展、變化的全過程，決定著AS的進展及斑塊穩定[7]。Kalinina等[8]首次發，現高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB-1)在AS病變中表達增高，是參與AS慢性炎癥進程中重要的炎癥介質之一。而在抑制AS形成過程中，調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)及其分泌的細胞因子在負向調節免疫應答方面起了重要作用。叉頭翼狀螺旋轉錄因子P3(Foxp3)在CD4+CD25調節性T淋巴細胞的功能上發揮著重要作用，是Treg的一個相對特異性標記[9]。多項動物實驗證實，Foxp3通過調控體內炎癥而具有抗AS的作用[10]。

為在活血化瘀的基礎上使調達氣機之力更擅，且兼化痰降濁之功，在血府逐瘀湯的基礎上，以枳實替代桔梗、枳殼、柴胡，并加入何首烏、澤瀉、山楂化痰降濁之品組成新血府逐瘀湯。在前期研究中證實，新血府逐瘀湯在防治AS的進程中具有調節脂質代謝、抑制血管內皮炎癥等作用，以降低心血管事件的發生[11]。本研究發現，AS模型大鼠在病理組織形態學改變的同時，HMGB-1陽性表達增高，考慮受損的血管內皮細胞和活化的炎性細胞可主動釋放大量的HMGB-1，刺激臨近的內皮細胞表達促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子等[12]，而這些炎癥介質可反向促進HMGB1和其他炎性因子釋放，造成AS血管的HMGB1水平明顯高于正常血管[13]。而新血府逐瘀湯干預后，HMGB1陽性表達水平顯著降低。

新血府逐瘀湯在降低HMGB1陽性表達的同時，Foxp3陽性表達水平升高，提示Treg細胞的功能發揮得到改善。相關性分析發現，兩者呈顯著負相關。考慮新血府逐瘀湯可直接作用于HMGB1，抑制相關炎癥因子分泌發揮抗AS作用，同時HMGB1可通過影響Treg細胞功能干預AS的進程。一方面HMGB1與Treg細胞上的TLR2、4結合抑制其功能發揮，加速AS的形成和發展；另一方面HMGB1可能激活Th17細胞，降低Foxp3的表達以及抑制IL-10的分泌，從而降低Tregs細胞的活性，導致細胞免疫平衡破壞使炎癥反應維持及放大[14]。

總之，新血府逐瘀湯通過對HMGB1表達的抑制及Foxp3表達的促進，調節促炎因子與抗炎因子之間的平衡，體現了中藥復方制劑多靶點、雙向調節作用的優勢，值得進一步探索與應用。

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Effects of New Xuefu Zhuyu Decoction on the Expression of Immunomodulatory Factors HMGB-1 and Foxp3 in Atherosclerosis Model Rats

JIANG Ting1, JI Wen-yan1△, SUI Yong-ni2, LIU Ni-na1, JI Zhong-qiang1
(1.QingdaoHaiciMedicalGroup,Qingdao266033,China;2.QingdaoCentralHospital,Qingdao266042,China)

Objective: By observing the effect of New Xuefu Zhuyu Decoction on aorta pathologymorphology and HMGB-1, Foxp3 expression in atherosclerosis model rats, explore its anti atherosclerosis mechanism by the regulation of immune factors. Methods:48 healthy male Wistar rats were randomly divided into blank control group, model group, western medicine group, low dose Chinese medicine group, high dose Chinese medicine group, and the group of high dose Chinese medicine plus western medicine. Except the blank group, other groups were copied to atherosclerosis model, low dose group and high dose group of Chinese medicine gavaged with New Xuefu Zhuyu Decoction at a concentration of 9 g/ (kg·d) and 18g/ (kg·d) respectively; western medicine group with aqueous solution of atorvastatin calcium 2 mg/(kg·d); these two programs administered by adding for Integrative Medicine group; simultaneously, the control and the model group were fed with volume of normal saline. After 8 weeks, the thoracic aortic pathology change was observed under light microscope with HE staining; the HMGB-1, Foxp3 expression of thoracic aortic was detected by immunohistochemical method, and then their correlativity was analyzed. Results: Compared with the model group, the New Xuefu Zhuyu Decoction could decrease the expression of HMGB-1 and increase the expression of Foxp3, and the two have a significant negative correlation.Conclusion:New Xuefu Zhuyu Decoction could down regulate proinflammatory factor HMGB-1 and upregulation of anti-inflammatory factor Foxp3 expression, to play the role of anti atherosclerosis by regulating the balance of inflammatory factor.

New Xuefu Zhuyu Decoction; Atherosclerosis; Immune regulation factor; HMGB-1; Foxp3

山東省中醫藥科技發展計劃重點專項(2013ZDZK-105)-新血府逐瘀軟膠囊對血瘀型心絞痛 FOXP3基因甲基化的干預研究；青島市醫藥科研指導計劃(2014-WJZD061)-新血府逐瘀湯干預動脈粥樣硬化模型大鼠免疫調節因子表達的研究

姜 婷(1984-)，女，山東青島人，主治醫師，醫學碩士，從事中醫藥心血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者：紀文巖，Tel：0532-83777551，E-mail：jiwenyan@sina.com。

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1006-3250(2017)04-0480-04

2016-12-22