當歸水煎液對刀豆蛋白A誘導急性肝損傷小鼠的保護作用?

陳 芯，馬雅鑾，李 蕊，朱鏐孌，王憲波，張劍平△

(1.北京中醫藥大學基礎醫學院，北京 100029；2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700；3.首都醫科大學附屬北京地壇醫院傳染病研究所，北京 100015；4.新發突發傳染病研究北京市重點實驗室， 北京 100015; 5.首都醫科大學附屬北京地壇醫院中西醫結合中心，北京 100015)

【實驗研究】

當歸水煎液對刀豆蛋白A誘導急性肝損傷小鼠的保護作用?

陳 芯1，馬雅鑾2，李 蕊3,4，朱鏐孌3,4，王憲波5，張劍平3,4△

(1.北京中醫藥大學基礎醫學院，北京 100029；2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700；3.首都醫科大學附屬北京地壇醫院傳染病研究所，北京 100015；4.新發突發傳染病研究北京市重點實驗室， 北京 100015; 5.首都醫科大學附屬北京地壇醫院中西醫結合中心，北京 100015)

目的：研究當歸水煎液對刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)誘導小鼠急性肝損傷的保護作用。方法：6～8周齡C57BL/6雄性小鼠，采用目內眥靜脈注射ConA方法制備急性肝損傷小鼠致死模型，同時給予當歸水煎液口服灌胃，觀察小鼠生存率；制備急性肝損傷非致死模型，10 h后檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平并進行病理染色，3 h、10 h后采用流式CBA(Cytometric Bead Array, CBA)方法，檢測血清細胞因子水平，造模3 h后采用實時定量PCR檢測肝臟誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA表達水平，造模6 h后檢測脾臟IFN-γmRNA表達水平。結果：與ConA模型組比較，給予當歸水煎液治療后生存率顯著升高，肝組織病理損傷減輕，血清ALT、AST水平降低。當歸水煎液治療后血清炎性細胞因子IL-12、IL-6和IFN-γ降低，肝臟iNOS mRNA表達水平降低，但對脾臟IFN-γ mRNA表達水平無明顯作用。結論：當歸水煎液對ConA誘導急性肝損傷小鼠具有抗炎和保肝作用。

當歸水煎液；刀豆蛋白A；急性肝損傷；細胞因子

急性肝損傷是人類常見疾病之一。急性肝損傷模型是現代研究肝臟疾病機理的重要工具，其模型種類較多，主要有四氯化碳、D-半乳糖胺、由卡介苗加脂多糖、ConA等[1]。目前應用最廣泛的是由Tiegs等[2]在1992年應用ConA誘導的小鼠特異性肝損傷模型。該模型是由多種免疫細胞介導的炎癥反應，它能較好地模擬人類自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等免疫性肝損傷的特征和病理機制。該模型在一定范圍內呈劑量依賴性，在0.15 mg/kg至30 mg/kg范圍內，血清轉氨酶水平隨劑量的增加而升高，用量大于20 mg/kg以上時8 h有小鼠死亡。肝組織學顯示，大量淋巴細胞和單核細胞浸潤，并出現不同程度的壞死，同時分泌大量炎性細胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12等[3-4]。

當歸(Angelica sinensis)為傘形科當歸屬植物的干燥根，具有補血調經、活血止痛、潤腸通便之功效，多用于治療血虛諸證、月經不調、跌打損傷、風濕痹痛、腸燥便秘等病癥[5-7]。近年來，隨著對當歸的深入研究發現，當歸對四氯化碳所致的動物藥物性急性肝損傷具有保護作用[8]。孫麗霞[9]等發現，當歸補血湯對免疫性肝損傷大鼠模型具有保護作用，其機制可能與抑制過氧化物反應及抗自由基損傷有關。本課題組在前期工作中采用治療肝損傷的經驗方解毒涼血方，發現其能顯著提高ConA小鼠急性肝損傷模型的生存率，降低血清轉氨酶水平。由于當歸是解毒涼血方的主要單藥，因此研采用ConA小鼠急性肝損傷模型給予當歸水煎液灌胃治療，通過觀察小鼠生存率，檢測肝功能水平和炎性細胞因子分泌，利用現代免疫學理論，探討當歸水煎液對ConA急性肝損傷小鼠的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1 中藥的制備

中藥的標準劑量參考全國統編《中藥學》第2版[10]教材。小鼠用藥劑量以70 kg成人的體表面積換算，小鼠用藥量是成人每公斤體質量的9.1倍，本實驗小鼠用藥量按成人每公斤體質量的10倍換算[11]。當歸6 g，購自北京同仁堂前門總店，按傳統方法將當歸用蒸餾水浸泡，武火煮沸，文火煎2次，去渣合并濃縮至75 ml，當歸水煎液濃度為0.08 g/ml分裝，-20℃保存備用。

1.2 試劑與主要儀器

小鼠細胞因子CBA試劑盒購于美國BD公司，ALT、AST檢測試劑盒購于四川麥克生物科技股份有限公司，720全自動生化分析儀購于日本日立公司，FACS Callibur流式細胞儀購于美國BD公司。RNA提取試劑及實時熒光定量PCR探針GAPDH、IFN-γ、iNOS等均購于Life Technology公司，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購于ABI公司，ConA購于SIGMA公司。

1.3 實驗動物

野生型C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，體質量(20±2)g，購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所(許可證號SCXK(京)2014-0004)，并按照動物保護相關法規飼養于該研究所SPF級實驗室。

1.4 模型制備

無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)配制6 mg/mL ConA儲液。將小鼠吸入麻醉10 s，內眥靜脈注射100 μL/只，ConA 30 mg/kg劑量制備急性肝衰竭小鼠致死模型，15 mg/kg劑量制備急性肝損傷小鼠非致死模型。主要分為3部分，一是生存率。采用致死模型，56只小鼠隨機分為2組各28只，ConA模型組和當歸水煎液組造模的同時分別給予250 μL灌胃雙蒸水或當歸水煎液1次；二是肝功能檢測。采用非致死模型，24只小鼠隨機分為正常組、ConA模型組、當歸水煎液組各8只，造模10 h后取外周血；三是細胞因子檢測。造模方法同上，18只小鼠隨機分為3組各6只，造模后3 h、10 h取外周血。肝臟iNOS、脾臟IFN-γmRNA表達檢測，造模方法同上，于造模3 h后取肝臟、造模后10 h取脾臟。

1.5 生存率

從模型小鼠造模、灌胃后計時開始，至小鼠死亡計時結束，連續觀察96 h。注射造模藥物后96 h未死亡的小鼠計為生存，記錄動物死亡時間點，并繪制生存曲線。

1.6 肝功能檢測

制備ConA非致死模型后10 h麻醉小鼠取外周血，2000 r/min離心15 min并分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清ALT和AST水平。

1.7 病理染色

制備ConA非致死模型10 h后取肝臟，置于10%中性緩沖福爾馬林固定液中，經脫水、包埋、切片、鋪片、HE染色、封片干燥后用光學顯微鏡觀察。

1.8 細胞因子檢測

制備ConA非致死模型后3 h、10 h分別麻醉小鼠取外周血，2000 r/min離心15 min分離血清，細胞因子采用小鼠細胞因子CBA試劑盒測定，按照說明書進行流式檢測。

1.9 實時定量PCR檢測

制備ConA非致死模型，3 h后分離肝臟，TRIzol法提取總RNA，按照試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，采用實時定量PCR方法檢測肝細胞iNOS表達水平，使用ABI SDS7500軟件分析結果。造模后10 h分離脾臟，檢測IFN-γ表達水平。

1.10 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，數據呈正態分布的計量資料采用t檢驗，生存曲線采用Kaplan-Meier統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 當歸水煎液對急性肝衰竭小鼠生存率影響

圖1顯示，造模后觀察96 h生存率并持續觀察小鼠狀態，發現ConA模型與對正常小鼠比較出現活動減少、呼吸加快、皮膚發涼、飲食減少、飲水減少等病態特征。造模4～6 h后2組小鼠均開始死亡，24 h內死亡較集中。但當歸水煎液組的小鼠明顯比模型組死亡緩慢，之后死亡頻率減緩，96 h后趨于穩定，且當歸水煎液組存活的小鼠狀態明顯好于模型組。經Kaplan-Meier統計分析，當歸水煎液組與模型組比較(P=0.020)，ConA模型組的生存率為21%，當歸水煎液組生存率為52%，提示當歸水煎液可提高ConA誘導急性肝損傷小鼠的生存率。

圖1 當歸水煎液對ConA急性肝衰竭小鼠生存率的影響注：*P<0.05

2.2 當歸水煎液對急性肝損傷小鼠血清轉氨酶的影響

表1顯示，為進一步評價當歸水煎液的療效，我們檢測各組血清轉氨酶的水平。ConA模型組與正常組比較ALT顯著升高(P=0.0005)，當歸水煎液組與ConA模型組比較ALT顯著降低(P=0.0068)；ConA模型組與正常組比較AST顯著升高(P=0.0004)，當歸水煎液組與ConA模型組比較AST顯著降低(P=0.0204)，提示當歸水煎液能減輕小鼠肝細胞損傷。

表1 當歸水煎液對ConA急性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平的影響

注：**P<0.001,*P<0.05

2.3 當歸水煎液對肝臟組織的影響

圖2顯示，正常組小鼠在光學顯微鏡下觀察可見，肝臟肝小葉結構完整清晰，肝細胞結構完好，大小均勻排列整齊，有明顯分界，無炎性細胞浸潤，未見腫脹及壞死，染色正常。ConA模型組小鼠肝臟大量白細胞浸潤，肝細胞形成大片壞死灶，當歸水煎液組小鼠肝臟白細胞浸潤減少，壞死灶面積減小，提示當歸水煎液可減輕小鼠肝組織損傷。

圖2 當歸水煎液對ConA急性肝損傷小鼠肝組織的影響(標尺50 μm, HE×200)

2.4 當歸水煎液對炎性細胞因子分泌的影響

表2顯示，由于大量炎性細胞因子分泌ConA誘導急性肝損傷的重要機制，因此我們檢測當歸水煎液對多種炎性細胞因子分泌的影響。造模后3 h、10 h取外周血，分離血清并檢測細胞因子水平。模型組與正常組比較，3 h血清中IL-12、IL-6升高，10 h 血清中IFN-γ升高。當歸水煎液組與ConA模型組比較，3 h血清中IL-12、IL-6炎性細胞因子顯著下降(P=0.049,P=0.03)，10 h血清中IFN-γ炎性細胞因子顯著下降(P=0.0045)，差異有統計學意義。3 h血清中TNF-α、MCP-1炎性細胞因子雖然下降，但差異有統計學意義(P>0.05)，提示當歸水煎液能有效降低早期血清IL-6、IL-12及晚期IFN-γ水平。

表2 當歸水煎液對急性肝損傷小鼠炎性細胞因子分泌的影響

注：**P<0.01;*P<0.05

2.5 當歸水煎液對脾臟IFN-γmRNA水平表達的影響

圖3顯示，由于CBA結果顯示當歸水煎液能降低晚期血清中IFN-γ分泌水平，故造模10 h后取脾臟提取mRNA，實時定量PCR檢測IFN-γ表達，發現模型組與正常組比較，脾臟IFN-γ mRNA表達升高(P=0.014)，當歸水煎液不能降低脾臟IFN-γ mRNA的表達(P=0.45)，提示當歸的抗炎作用不是直接作用于淋巴細胞。

圖3 當歸水煎液對脾臟IFN-γmRNA表達的影響 注：*P<0.05

2.6 當歸水煎液對肝臟iNOS mRNA水平表達的影響

圖4顯示，由于當歸水煎液的作用靶點不是淋巴細胞，因此我們驗證藥物的作用是否作用于天然免疫細胞。iNOS與機體炎癥損傷程度呈正相關，并且給CBA結果顯示，當歸水煎液能降低早期血清中多種細胞因子水平，故造模3 h后取肝臟提取mRNA，實時定量PCR檢測iNOS表達。ConA模型組與正常組比較，肝臟iNOS表達升高(P=0.0023)；與ConA模型組比較，當歸水煎液組可降低肝臟iNOS表達(P=0.038)，提示當歸水煎液抑制巨噬細胞活性。

圖4 當歸水煎液對肝臟iNOS mRNA表達的影響 注：**P<0.05, *P<0.05

3 討論

急性肝損傷是由各種肝臟疾病所導致的病變結果[12]，其發病機制復雜、病因眾多，但以免疫性損傷較為多見[13-14]。免疫性肝損傷的共同機制主要有兩方面，一方面T淋巴細胞增殖活化，并被募集浸潤肝臟，導致肝損傷；另一方面多種免疫細胞釋放大量炎性細胞因子，加劇肝細胞損傷[15]。

中醫認為肝損傷屬于“脅痛”“黃疸”“積聚”“疫毒”等范疇，其病因主要有濕、熱、瘀、毒。歷代醫家對肝病治法甚多，大致可歸納出肝病治療原則為疏通氣血、清熱解毒，故活血行氣化瘀、清熱解毒類中藥是臨床治療肝損傷的主要藥物[16]。當歸入肝經，具有行氣活血的作用，是臨床常用活血、調經止痛、抗炎藥。本研究結果表明，當歸水煎液可提高ConA導致急性肝損傷小鼠的生存率，降低血清ALT、AST水平，改善肝組織病理損傷和白細胞浸潤，說明其具有保肝作用。

本研究在此基礎上進一步探討了當歸水煎液的保肝作用機理。當歸水煎液能降低血清炎性細胞因子IL-12、IL-6、IFN-γ水平，IL-12等促炎性細胞因子在ConA誘導的肝損傷中發揮關鍵作用。因此本研究結果提示，當歸水煎液通過抑制炎癥反應發揮保肝作用。IL-12主要來源于單核/巨噬細胞，能進一步啟動Th1免疫應答，同時促進分泌IFN-γ，進而炎癥損傷開始循環放大。動物實驗顯示，給予小鼠IL-12抗體干預后，能顯著降低ConA誘導小鼠肝損傷血清IFN-γ、IL-6等細胞因子水平[17]，因此IL-12是介導ConA模型炎癥損傷的關鍵細胞因子。IL-6主要由單核細胞和巨噬細胞產生并參與免疫防御過程，同時可介導炎癥反應。IL-6在ConA模型中發揮雙向作用，在肝損傷早期發揮保護作用，晚期發揮促炎作用[18]。本研究中，給予當歸水煎液治療后3 h，血清IL-12和IL-6降低，說明當歸水煎液在早期降低炎性細胞因子的分泌，抑制炎癥反應的循環放大。

IFN-γ主要由活化的T細胞產生，IL-12可誘導其表達，具有活化單核細胞、巨噬細胞并促進其分泌IL-1、IL-6、TNF-α等作用，還能活化中性粒細胞，刺激血管內皮細胞和白細胞產生黏附分子。而在ConA誘導的肝損傷模型中，脾中的T淋巴細胞增殖活化成為效應T細胞，經趨化因子和黏附分子的作用，被肝竇內皮細胞募集至肝竇和肝小葉部位[19-20]，浸潤的效應T細胞持續向Th1型CD4+T細胞分化，分泌IFN-γ等細胞因子，啟動Th1免疫應答[19-21]。文獻表明，與野生型小鼠比較，IFN-γ基因敲除小鼠給予ConA注射后生存率明顯升高[22]。本實驗結果與模型組比較，當歸水煎液組雖然能降低血清IFN-γ水平，但脾臟IFN-γ mRNA水平并未降低，提示當歸水煎液并不直接作用于淋巴細胞。

巨噬細胞是天然免疫應答中的重要成員，具有吞噬、殺傷、遞呈抗原、分泌生物活性物質等多種免疫功能，是機體非特異性免疫的重要組成部分[23-24]。在ConA誘導的急性肝損傷模型中，受損的細胞釋放出各種損傷相關模式分子，導致巨噬細胞活化。特異性清除巨噬細胞能減輕肝損傷，說明巨噬細胞能發揮關鍵作用。活化的巨噬細胞中合成的 iNOS在肝損傷時表達上調，合成一氧化氮(NO)造成肝組織損傷，繼而導致肝實質細胞的凋亡、壞死。本研究給予當歸水煎液治療后，肝臟iNOS mRNA表達水平降低，提示當歸水煎液可抑制巨噬細胞活化。

綜上所述，本研究中當歸水煎液可減輕ConA誘導小鼠肝損傷，其機制可能是通過降低炎性細胞因子的分泌，并抑制作用于天然免疫的巨噬細胞活化，從而阻抑炎癥損傷進一步循環放大有關。

[1] 張琪, 陳輝, 彭順利, 等. 肝損傷動物模型制備研究進展[J]. 吉林醫藥學院學報, 2011, 32(4): 216-220.

[2] G. TIEGS, J. HENTSCHEL, A. WENDEL. A T Cell-dependent Experimental Liver Injury in Mice Inducible by Concanavalin A[J]. The Journal Clinical Investigation,1992,90(1):196-203.

[3] WATANABE Y, MORITA M, AKAIKE T. Concanavalin A induced perforin-mediated but not Fas-mediated hepatic injury[J]. Hepatology, 1996, 24(3):702-710．

[4] 江海濤, 任源浩, 吳雨龍, 等. 不同劑量刀豆蛋白A誘導小鼠肝臟急性員傷的實驗研究[J]. 現代預防醫學, 2014, 41(12) :2220-2223.

[5] WANG Q, DING F, ZHU N, et al. Determination of the compositions of polysaccharides from Chinese herbs by capillary zone electrophoresis with amperometric detection[J]. Biomedical chromatography, 2003, 17(7):483-488.

[6] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京:中國醫藥科技出版社, 2010:170.

[7] 劉醫輝, 楊世英, 馬偉林, 等. 當歸藥理作用的研究進展[J]. 中國當代醫藥, 2014, 21(22):192-196.

[8] 寧康健,張子明，司陽洋,等. 當歸對四氯化碳肝損傷的保護作用的電鏡觀察[J].中國實驗方劑學雜志,2009,15(12):68-70.

[9] 孫麗霞, 方南元, 周玲玲, 等.當歸補血湯及拆方對大鼠免疫性肝損傷的治療作用[J].南京中醫藥大學學報,2014,30(2):150-152.

[10] 高學敏.中藥學[M]. 2版. 北京:中國中醫藥出版社, 2007:234.

[11] 施新猷. 醫學實驗動物學[M]. 陜西: 陜西科學技術出版社, 1989:368.

[12] 黃娜娜, 孫蓉. 適宜于中藥抗急性肝損傷活性發現與藥效評價的動物模型應用概況[J]. 中國藥物警戒，2015, 12(11):669-673.

[13] 申弘, 聶紅明, 葉青艷, 等. 免疫性肝損傷動物模型研究進展[J]. Chinese Hepatology, 2014, 19(10):790-796.

[14] 凌銀嬋, 劉海燕, 黃巨恩, 等. 急性肝損傷實驗動物模型的研究進展[J]. 解剖學雜志, 2012, 35:389-391.

[15] KOERBER K, SASS G, KIEMER AK, et al. In vivo regulation of inducible NO synthase in immune-mediated liver injury in mice[J]. Hepatology, 2002, 36(5):1061-1069.

[16] 黃自平, 梁廣寰, 阮幼冰， 等. 當歸對大鼠慢性CCl4肝損傷時肝臟超微結構的影響[J]. 中西醫結合肝病雜志, 1996, 6(1):16-24.

[17] ZIMMERMANN HW，TRAUTWEIN C，TACKE F． Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury[J]. Frontiers in Physiology, 2012,3: 56．

[18] YOH-ICHI TAGAWA, PATRICK MATTYS, HUBERTINE HEREMANS. Bimodal role of endogenous interleukin-6 in concanavalin A-induced hepatitis in mice[J]. Journal of leukocyte Biology, 2000, 67:90-96.

[19] TIEGS G, HENTSCHEL J, WENDEL A. A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A[J]. Journal of clinical investigation， 1992, 90(1): 196-203.

[20] EKSTEEN B, AFFORD SC, WIGMORE SJ, et al. Immune-mediated liver injury[J]. Seminars in liver disease， 2007，27(4): 351-366.

[21] CHANG CP, YANG MC, LEI HY. Concanavalin A/IFN-gamma triggers autophagy-related necrotic hepatocyte death through IRGM1-mediated lysosomal membrane disruption[J]. Plos one， 2011, 6(12): e28323.

[22] CHIH-PENG CHANG, MING-CHEN YANG, HUAN-YAO LEI. Concanavlain A/IFN-Gamma Triggers Autophagy-Related Necrotic Hepatocyte Death through IRGM1-Mediated Lysosomal Membrane Disruption[J]. PLOS ONE, 2011, 6(12):1-9.

[23] BOWDISH DM, LOFFREDO MS, MUKHOPADHYAY S, et al. Macrophage receptors implicated in the “adaptive” form of innate immunity[J]. Microbes and infection， 2007, 9(14-15):1680-1687.

[24] BELL LN, CHALASANI N. Epidemiology of idiosyncratic drug-induced liver injury [J]. Seminars in liver disease, 2009, 29(4):337-347.

Protective Effect of Angelic Decoction on Acute Liver Injury Mice Induced by Concanavalin A

CHEN Xin1, MA Ya-luan2, LI Rui3,4, ZHU Liu-luan3,4, WANG Xian-bo5, ZHANG Jian-ping3,4△
(1.SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.InstituteofBasicTheory,ChinaAcademyofChineseMedicine,Beijing100700,China; 3.InstituteofInfectiousDiseases,BeijingDitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing10015,China; 4.BeijingKeyLaboratoryofEmergingInfectiousDisease,Beijing100015,China; 5.CenterofIntegrativeMedicine,BeijingDitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100015,China)

Objective: To investigate the protective effect of Angelic decoction on acute liver injury mice induced by Concanavalin A (ConA). Methods: Preparing acute liver injury mice model, 6-8 weeks old C57BL/6 male mice were adopted by intravenous injection of ConA. The survival rate was observed on the lethal model. For the sub-lethal model, 10hour later, the mice were sacrificed to measure the levels of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST)and liver HE staining; at 3h and 10h,the serum cytokines were measured by Cytometric Bead Array；the liver inducible nitric oxide synthase was measured at 3h and the spleen interferon γ was measured at 10h by real-time PCR. Results: Compared with normal mice, after giving treatment of Angelic decoction, the survival rate of acute liver injury model was increased remarkable, the liver tissue injury were reduced and the serum levels of ALT, AST were decreased, the serum inflammatory cytokines IL-12，IL-6 and IFN-γ were decreased, the liver iNOS mRNA expression were decreased, but had no effect on the spleen IFN-γ mRNA expression. Conclusion: Angelic decoction has anti-inflammatory and liver protection effect on acute liver injury induced by ConA in mice.

Angelic decoction; Concanavalin A; Acute liver injury; Cytokine

國家自然科學基金面上項目(81273743)-解毒涼血方阻抑IL-12家族生成治療急性肝衰竭的機制研究

陳 芯(1990-)，女，遼寧大連人，在讀碩士，從事中西醫結合基礎免疫研究。

△通訊作者：張劍平(1959-)，女，研究員，醫學碩士，碩士研究生導師，從事中西醫結合基礎免疫研究，Tel:010-84322622，E-mail：zhjp2358@126.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)04-0492-04

2016-09-12